Инвитро или cmd: Где дешевле и лучше сдавать анализы в Москве

Содержание

Профили анализов на выявление заболеваний и проверку здоровья

Биохимия крови: минимальный профиль

Скрининговое биохимическое обследование, помогающее сделать первичную оценку состояния здоровья, определить ход дальнейшего обследования. Для использования в рамках диспансерного обследования и по назначению врача.

Оценка андрогенного статуса

Комплекс, используемый для оценки андрогенного статуса у женщин при диагностике причин гирсутизма, нарушений менструального цикла, бесплодия.

Хочу стать мамой: комплексное обследование при планировании беременности

В профиль входит комплекс тестов на гормоны, позволяющих выявить эндокринные дисфункции репродуктивной системы, базовый комплекс инфекционных маркеров для выявления потенциально опасных для плода инфекций и определения наличия иммунитета к TORCH-инфекциям, а также скрининговые биохимические и общеклинические тесты.

TORCH-инфекции

Комплекс исследований, в который входят лабораторные маркеры, позволяющие при планировании зачатия или во время беременности оценить наличие иммунитета к потенциально опасным для плода TORCH-инфекциям, а также выявить острую инфекцию.

Беременность: 1-й триместр (1-13 недели)

Пренатальный скрининг беременных на сроке 11-14 недель беременности выполняют для оценки риска наличия трисомии 21 (синдром Дауна) и трисомий 13/18 у плода.

Беременность: 2-й триместр (14-28 недели)

Скрининговое обследование беременных во втором триместре беременности проводят для оценки риска хромосомных патологий и дефекта нервной трубки плода. Обследование особенно целесообразно при пограничных результатах расчетного риска хромосомной патологии при скрининге 1-го триместра, а также, если скрининговое обследование в 1-м триместра не было проведено в срок.

Подготовка к беременности: базовый

Лабораторные исследования в рамках прегравидарной подготовки включают диагностику бактериального вагиноза и ИППП, наличие иммунитета к TORCH-инфекциям, определение группы крови и резус-фактора, клинические и биохимические анализы крови, оценку функции щитовидной железы.

Подготовка к беременности: оценка витаминного статуса

Тесты, входящие в состав профиля, направлены на выявление недостаточности витаминов D, В9 и В12 в процессе прегравидарной подготовки. Результаты обследования можно использовать для коррекции пищевого рациона и снижения возможных рисков, связанных с их дефицитом.

Подготовка к беременности: скрытый дефицит железа

Тесты, входящие в состав профиля, направлены на выявление в процессе прегравидарной подготовки риска развития железодефицитной анемии Результаты обследования можно использовать для коррекции пищевого рациона и/или для выбора терапии.

Анализы для детского сада и школы

Программа обследования ребенка предназначена для прохождения перед поступлением в детский сад или школу. Результаты этих исследований необходимы для получения медицинской справки по утвержденной Минздравом РФ форме 026У.

Оценка иммунного ответа к детским инфекциям

Программа содержит ряд тестов, позволяющих оценить наличие у ребенка иммунитета к наиболее распространенным детским инфекциям (вследствие перенесенного заболевания или вакцинации).

Данный профиль будет полезен и в том случае, если у родителей отсутствует информация о перенесенных ребенком заболеваниях, или в медицинской карте не хватает данных о необходимых прививках.

Анализы для детского сада и школы (1601)

ИНБИОФЛОР. Выявление возбудителей ИППП(4+КВМ)

Комплекс тестов для диагностики бактериального вагиноза − инфекционного невоспалительного синдрома полимикробной этиологии, развивающегося из-за изменения соотношения нормальной и условно-патогенной микрофлоры влагалища.

ИНБИОФЛОР. Условно-патогенные микоплазмы, скрининг

ВИЧ, сифилис, гепатит В, С

Скрининговый набор тестов, направленный на выявление ВИЧ-инфекции, сифилиса и гепатитов В и С, в рамках профилактического обследования или при госпитализации.

VIP-обследование для женщин

Комплекс тестов, предназначенный для профилактического обследования женщин. В комплекс входят общеклинические, базовые биохимические, гормональные исследования, а также маркеры инфекций, позволяющие судить о состоянии иммунитета по отношению к ним и/или наличии определенных заболеваний.

VIP-обследование для мужчин

Комплекс тестов, предназначенный для профилактического обследования мужчин. В комплекс входят общеклинические, базовые биохимические, гормональные исследования, а также маркеры инфекций, позволяющие судить о состоянии иммунитета по отношению к ним и/или наличии определенных заболеваний.

Аллергия на пищевые продукты

Комплекс тестов (общий и специфические IgE), использующийся для выявления сенсибилизации к различным пищевым аллергенам.

Аллергия на плесень

Комплекс тестов (общий и специфические IgE), использующийся для выявления сенсибилизации к аллергенам плесени.

Аллергия на растения

Комплекс тестов (общий и специфические IgE), использующийся для выявления сенсибилизации к аллергенам пыльцы трав и деревьев.

Большой скрининг элементного состава ногтей

Диагностический профиль, который включает в себя максимальный перечень определяемых макро- и микроэлементов. Рекомендуется как профилактическое исследование или в рамках программы общей диагностики.

Токсичные и эссенциальные микроэлементы в ногтях

Тесты, входящие в состав профиля, позволяют выявить или исключить длительную существующую интоксикацию основными токсичными микроэлементами, а также интоксикацию при избыточном накоплении ряда эссенциальных микроэлементов в организме.

Токсичные микроэлементы в ногтях

Тесты, входящие в состав профиля, позволяют выявить или исключить длительную существующую интоксикацию основными токсичными микроэлементами.

Токсичные микроэлементы в волосах

Эссенциальные (жизненно необходимые) и токсичные микроэлементы в моче

Профиль выполняют для подтверждения интоксикаций при избыточном накоплении ряда микроэлементов в организме (как токсичных, так и некоторых эссенциальных, присутствующих в токсических концентрациях), а также для контроля за течением заболеваний обмена веществ, приводящим к потерям эссенциальных микроэлементов.

Токсичные микроэлементы (тяжёлые металлы) в цельной крови

Тесты, входящие в профиль, направлены на выявление самых токсичных и наиболее распространенных в окружающей среде тяжелых металлов. Профиль рекомендован на предмет скрининга (в т. ч. массового) с целью выявления интоксикаций этими микроэлементами.

Красота здоровой кожи

Тесты, входящие в данный профиль, помогут оценить состояние эндокринной системы, выявить возможный гормональный дисбаланс и определить его влияние на здоровье кожи.

Нейротропные витамины

Профиль предназначен для оценки уровня в крови основных витаминов группы В, необходимых для нормального функционирования нервной системы.

Вегетарианцы

Разработанный специально для вегетарианцев комплекс анализов поможет оценить питание с точки зрения полноценности и достаточности, выявить его возможное влияние на отдельные показатели крови (общий белок, кальций, фосфор, ферритин, витамины В12 и D), важные для обеспечения функции кроветворной, костно-мышечной и нервной систем.

Питание, исключающее красное мясо

Тесты, входящие в профиль, направлены на выявление дефицита белка и витамина В12 с целью определения возможных причин последствий несбалансированного питания.

Белковая диета

Комплекс анализов, разработанный специально для поклонников белковых диет, поможет оценить полноценность такого питания, определить его влияние на состав крови, на состояние выделительной системы и опорно-двигательного аппарата.

Профиль Веганы «Минимальный»

Профиль включает минимальный набор исследований для людей, придерживающихся веганского типа питания, полностью исключающего продукты животного происхождения из рациона.

Профиль Веганы «Базовый»

Профиль включает базовый набор исследований для людей, придерживающихся веганского типа питания, полностью исключающего продукты животного происхождения из рациона.

Профиль Веганы «Расширенный»

Профиль включает расширенный набор исследований для людей, придерживающихся веганского типа питания, полностью исключающего продукты животного происхождения из рациона.

Перед диетой: минимальное обследование

Тесты, входящие в состав профиля, позволяют определить наиболее частую причину повышения массы тела, выявить лабораторные признаки нарушения функции щитовидной железы, оценить необходимость дополнительного обследования, индивидуальной коррекции диеты, эффективность диетотерапии.

Перед диетой: дополнительное обследование

Тесты, входящие в состав профиля, дают возможность оценить состояние органов и систем организма, исключить вторичный характер ожирения на фоне заболеваний, приводящих к нарушению обмена веществ, выработать индивидуальный подход к составлению программы похудения с учетом имеющихся ограничений и отдельных противопоказаний, обусловленных текущим состоянием здоровья.

SuperSport — Базовый

Исследования, входящие в состав профиля, позволяют оценить исходное состояние здоровья до старта тренировок и его изменение под влиянием физических нагрузок в начале тренировок.

SuperSport — Оптимальный

Исследования, входящие в состав профиля, целесообразно выполнять при регулярных и активных физических нагрузках для детального отслеживания изменений, происходящих в организме, сравнения их с результатами предыдущего лабораторного исследования и, при необходимости, корректировки режима тренировок.

SuperSport — Продвинутый

Исследования, входящие в состав профиля, проводят с целью полного комплексного обследования, мониторинга реакции организма на серьезные и продолжительные нагрузки и степени последующего восстановления.

Исследования, которые закрыты для выполнения в лаборатории ИНВИТРО

Микробиота по Осипову	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Исследование под таким названием в его текущем виде вызывает серьезную критику экспертов вследствие практически полного отсутствия стандартизации и адекватного контроля качества выдаваемых результатов. Не относится к методам доказательной медицины.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Не планируется к вводу в ИНВИТРО.
Сиаловая проба Сиаловые кислоты Серомукоид	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревшие, нестандартизованные, выходящие из употребления тесты для диагностики заболеваний соединительной ткани. Также применялись для диагностики острого воспаления.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Следует ориентироваться на текущие рекомендации по диагностике или контролю активности конкретного заболевания В частности, если речь о ревматоидном артрите: — основные лабораторные тесты, рекомендуемые для диагностики ревматоидного артрита — № 44 Ревматоидный фактор (РФ) и № 1204 АЦЦП (Антитела к циклическим цитруллинированным пептидам). — для контроля активности ревматоидного артрита — №43 СРБ (С-реактивный белок), № 139 (СОЭ)
Остаточный азот	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревший тест для оценки состояния белкового обмена, оценки выделительной и фильтрационной функции почек.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №22 «Креатинин (в крови)» №26 «Мочевина (в крови)» №27 «Мочевая кислота (в крови)» №96 Проба Реберга (оценка скорости клубочковой фильтрации в почках).
LE- клетки	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревший тест, используемый ранее для диагностики системной красной волчанки (СКВ). LE-клетки– «клетки красной волчанки» — выявление в мазке крови нейтрофильных лейкоцитов, содержащих фагоцитированные ядра погибших лейкоцитов. Указывает на наличие в циркуляции антинуклеарных (противоядерных) аутоантител.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: В настоящее время используют более чувствительные, специфичные для системной красной волчанки (СКВ) серологические тесты: №126 «Антитела класса IgG к двуспиральной (нативной) ДНК» № 956 Антитела к нуклеосомам. См. также рекомендуемые профили тестов этого направления: № 4060 «СКВ, обследование». №4061 «Дифференциальная диагностика СКВ и других ревматических заболеваний». №4069 «Мониторинг активности СКВ».
Тимоловая проба	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревший, нестандартизованный тест, проба, выявляющая нарушение соотношения белков сыворотки, обычно наблюдаемое при патологии печени.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Для диагностики и оценки активности патологического процесса в печени применяют комплексные лабораторные исследования, включающие: — маркеры вирусных гепатитов, — печеночные ферменты (АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочная фосфатаза), — билирубин общий и прямой, — белок и белковые фракции сыворотки, — общий анализ мочи (пигменты мочи) См. также. комплексы тестов: Обс58 – Первичное обследование на наличие гепатита (А,В,С) Обс56 Обследование печени расширенное Лицензированные программы неинвазивной (без биопсии) оценки стадии патологического процесса в печени: ФИБРОТЕСТ (оценка фиброза и активности воспаления) ФИБРОМАКС (оценка фиброза, стеатоза, активности воспаления, алкогольного стеатогепатита, неалгокольного стеатогепатита.
Растворимые комплексы фибрин-мономера (РКМФ, РФМК)	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Нестандартизованный тест ручного исполнения с субъективной оценкой результата, оценивающий количество молекул-предшественников нерастворимого фибрина. Применяют для оценки активации процессов свертывания.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: В настоящее время для оценки активации процессов свертывания и фибринолиза, рекомендуют использовать стандартизированный, автоматизированного исполнения тест №164 «D-димер». Д-димер не является полным аналогом РФМК, но применяется обычно в тех же целях.
Хагеман-зависимый фибринолиз	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Ручная методика, довольно затратная по времени, не стандартизируемая и не автоматизируемая. Лаборатория ИНВИТРО не поддерживает применение не стандартизированных методик.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Не выполняем
Тромбоэластограмма (ТЭГ) Агрегация тромбоцитов Индуцированная агрегация тромбоцитов Время свертывания крови по Ли-Уайту Время кровотечения Время свертывания	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Особенность данных исследований — необходимость проводить их сразу после взятия биоматериала (в течении нескольких минут) — т. е. «у постели больного». Поэтому централизованные лаборатории (в условиях необходимости транспортировки материала в лабораторию) не могут гарантировать качественные результаты .	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Стандартный набор тестов для характеристики состояния истемы свертывания крови: №1 «АЧТВ», №2 «Протромбин, МНО (протромбиновое время)», №3 «Фибриноген», №5, №119 — Общий анализ крови с подсчетом лейкоформулы (включает подсчет тромбоцитов на анализаторе и дополнительную проверку патологических результатов с помощью микроскопии мазка). В целях диагностики тромбофилий см. также тест №122 ГП Гиперагрегация тромбоцитов (генетические факторы риска тромбоза. Анализ наличия полиморфизмов в генах интегрина альфа-2 и тромбоцитарного гликопротеина 1b.
Агрескрин-тест	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревший, выходящий из употребления тест для исследования агрегации тромбоцитов. Централизованные лаборатории (в условиях необходимости транспортировки материала в лабораторию) не могут гарантировать качественные результаты.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Стандартный набор тестов для характеристики состояния системы свертывания крови: №1 «АЧТВ», №2 «Протромбин, МНО (протромбиновое время)», №3 «Фибриноген», №5, №119 — Общий анализ крови с подсчетом лейкоформулы (включает подсчет тромбоцитов на анализаторе и дополнительную проверку патологических результатов с помощью микроскопии мазка).
Тромботест	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Под этим названием может подразумеваться тест, аналогичный исследованию протромбина или тромбинового времени.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №2 «Протромбин, МНО (протромбиновое время)» № 194 Тромбиновое время
Этаноловый тест	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревший, выходящий из употребления ручной, нестандартизированный тест, направленный на диагностику ДВС-синдрома.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Современный тест данного направления — №164 «D-димер»
Вирус гепатита D колич. методом ПЦР. Вирус гепатита TT колич. методом ПЦР Вирус гепатита E колич. методом ПЦР Вирус гепатита G колич. методом ПЦР	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО На сегодняшний день в России не существует надежных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №325 «Вирус гепатита D, определение РНК (HDV-RNA)качественный формат» №326 «Вирус гепатита G, определение РНК (HGV-RNA),качественный формат»
Токсокара IgE	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Нет надежных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Исследование на боррелию методом ПЦР, кровь	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Выявление ДНК боррелий в крови обычно в диагностике боррелиоза не используют. Этот метод в целях диагностики ранней инфекции (т.е. для исследования крови, где концентрация может быть очень низкой) — не пригоден из-за недостаточной чувствительности.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №243 «Антитела класса IgG к Borrelia burgdorferi», №244 «Антитела класса IgM к Borrelia burgdorferi» №1191 Антитела класса IgM к боррелиям методом Вестерн-блота (раздельный ответ по 9 антигенам).
Онкопротеины Е7 и Е6 ВПЧ методом ИФА	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Нет надежных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №394 «Вирус папилломы человека Digene-тест (определение ДНК-типов высокого онкогенного риска 16/18/31/33/35/39 /45/51/52/56/58/59/68 типы) (соскоб)» №395 «Вирус папилломы человека Digene-тест (определение ДНК-типов низкого онкогенного риска 6/11/42/43/44 типы) (соскоб)»
Антиядерные антитела в слезе Антитела класса IgG к двуспиральной (нативной) ДНК в слезе Антитела к фосфолипидам IgM/IgG в слезе	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Исследование не имеет клинической обоснованности ввиду малоинформативного биоматериала (слеза).	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: При подозрении на системные аутоиммунные заболевания используют исследование крови на соответствующие типы аутоантител (№1267 АНФ, №125 АНА, №125 анти-дс-ДНК, №№ 969, 997 Антитела к кардиолипину IgG IgM и др.)
Антитела к b-ХГЧ	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Нет общепринятого мнения о клинической значимости данного теста, отсутствуют тест-системы надежного уровня качества, отработанные для клинического применения.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: Комплексная программа №81 «Проблемы невынашивания: аутоиммунный профиль»
Антитела к Прогестерону	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО На сегодняшний день в России не существует надежных зарегистрированных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Гепатит С – серология (количественное или полуколичественное)	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Исследование антител к вирусу гепатита С применяют в целях диагностики этой инфекции и только в качественном формате теста (положительно/отрицательно). Этот тест не используют в количественном формате, поскольку это не имеет клинического значения ни для диагностики, ни для контроля лечения. Для контроля лечения используют количественное исследование РНК вируса методом ПЦР (тесты №№350, 323).	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: №79 «Anti-HCV-total (антитела к антигенам вируса гепатита C)» №1143 «Антитела к вирусу гепатита С, IgG (иммуноблот)» №350 «Количественное определение РНК вируса гепатита С (HCV) методом ПЦР» №323 «Вирус гепатита С, определение РНК (количественное)»
Кристаллообразующая способность мочи	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Не является сертифицированном исследованием. Используется в исследовательских целях.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Посев на хламидии	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Тест пока не включен в рекомендуемые алгоритмы ведения беременных, в том числе и по причине соотношения стоимости и необходимости этого теста.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Генотипирование гепатита В	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО На сегодняшний день в России не существует надежных зарегистрированных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Пантокальцин	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО На сегодняшний день в России не существует надежных зарегистрированных тест-систем, позволяющих выполнять данные исследования с необходимой точностью и достоверностью результатов.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Альдолаза	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Тест не имеет какой-либо особенной клинической значимости и вполне заменяется другими тестами.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: В диагностике патологии мышц – см. №19 «Креатинкиназа» №9 АСТ, № 21 Миоглобин, № 939 Миозит-специфичные антитела, панель В диагностике патологии печени » № 8 АЛТ, №9 АСТ
Ультракаин или другой анестетик (аллергия на анестезию)	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Исследование на аллергию к лекарственным препаратам не обладают достаточной чувствительностью и велик риск ложноотрицательного результата.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Количественные ПЦР (бактериальные инфекции)	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Не существует международных стандартов (эталонов), относительно которых производители могут стандартизовать количественные параметры своих наборов. По ряду возбудителей — безусловные патогены (Chlamydia tr., Neisseria g.,Mycoplasma genit., Trichomonas vag.), ненужно определять количество, так как факт выявления возбудителя требует лечения до полного исчезновения возбудителя. Есть условно-патогенные микроорганизмы (Ureaplasma,Candida,Gardnerella и т.д.), которые могут вызывать заболевания , если их количества превышает определенный порог .Метод ПЦР не является основным методом в диагностике вагинитов или баквагиноза, а только дополнительным . Так, что в первую очередь клиентов надо правильно ориентировать на решение клинических задач другими тестами в меню ИНВИТРО (микроскопия мазка, классическая микробиология, клинические данные пациента). Кроме того метод ПЦР в силу объективных причин дает большую неопределенность измерения, а исследуемый материал- урогенитальный соскоб трудно стандартизовать, т.е. выдача результатов в количественном формате, в виде цифры будет вводить в заблуждение врача и пациента.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: ИНВИТРО придерживается мнения, что для диагностики и мониторинга терапии при заболеваниях ИППП не нужно количественно измерять число копий условно-патогенных микроорганизмов в пробе, важно оценивать комплексно состояние микрофлоры, т.е. соотношение нормальной, условно-патогенной и т.д. микрофлоры. № 383 Скрининг микрофлоры урогенитального тракта (13+КВМ), соскоб эпителиальных клеток урогенитального тракта; №372 ФЕМОФЛОР-17+КВМ, соскоб эпителиальных клеток урогенитального тракта; 446КЧА-Ф Посев отделяемого на микрофлору, определение чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам; №440/444Посев на M.hominis и Ureaplasma spp. и определение чувствительности к антимикробным препаратам ,т.д.
Копропорфирины	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Устаревшая нестандартизируемая и неавтоматизируемая ручная методика, затратная по времени.	Клинически более правильными исследованиями являются следующие тесты: нет
Антибиотикограмма условно-патогенной микрофлоры в низком титре (≤10*4 кое/тамп.)	Характеристика теста, не допускающая его выполнение в лаборатории ИНВИТРО Почему ИНВИТРО не делает антибиотикограмму в случае выявления условно-патогенной микрофлоры в низком титре? • Во всех источниках информации ИНВИТРО по микробиологическим исследованиям (справочник, Методическое пособие…, сайт, бланк направления на исследование) есть примечание, что В случаях обнаружения нормальной, сопутствующей, условно-патогенной в низком титре (≤10*4 кое/тамп., мл., грам.) или не имеющей диагностического значения флоры, определение чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам не проводится. При этом пациент подписывает бланк, соглашаясь на данные условия. • Данное условие распространяется на те виды исследований, которые обозначены как «посев на флору», в то время, как тесты специфические (посев на определенный вид микроорганизма – стафилококк, кишечная палочка и др.) выполняются с постановкой АМП (чувствительности к антимикробным препаратам) в любом случае (при любом титре искомого микроорганизма). • Регламентирующие и информационные документы: 1. Приказ МЗ СССР от 22 апреля 1985г. №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». 2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04. 3. Практические аспекты современной микробиологии. Л.З.Скала, С.В.Сидоренко, А.Г.Нехорошева, С.П.Резван, В.П.Карп – 1997г. 4. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии под ред. Л.С.Страчунского, Ю.Б.Белоусова, С.Н.Козлова, 2007г. • Основным принципом медицины при любых формах государственного устройства является «не навреди». Нерациональное бесконтрольное применение антибактериальных препаратов приводит к распространению антибиотикорезистентности. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога (п.3 . МУК 4.2.1890-04).

Отзывы к CMD-Центр молекулярной диагностики.

Хочется рассказать о действительном хорошем сервисе данного центра. Нам с ребенком срочно нужно было пройти обследование, так как затягивать с лечением болезни нельзя было, да и мы уже оббегали все возможные диагностические центры, но там слишком дорого приходилось платить из-за срочности обыкновенных анализов. Спустя долгие поиски мы все-таки нашли очень хороший центр, который проводит очень качественные и быстрые обследования, не прося за это огромную кучу денег. Доча сдала все анализы за 1 день, а на третий мы уже понесли все справки лечащему врачу. Так что если у Вас сложная ситуация, и Вы никак не успеваете ждать результатов в государственной больнице, а на дорогие частники не хватает сбережений — то обращайтесь в «Центр молекулярной диагностики» и все будет хорошо.

Готовимся к ЭКО. Знаете, наверное , что это не дешево. Как-то не очень хочется повторять процедуру, если результаты окажутся неточными. Уже обращались в Центр молекулярной диагностики. Решили снова пойти сюда. Анализы взяли в день обращения, Результаты прислали СМС-кой. Администратор Екатерина дала подробную консультацию и предоставила скидку! Сдавали на Лобова ,4. Спасибо всем сотрудникам Центра.

Так получилось, что понадобился генетически анализ. Решила обратится в ГЦЗ. Разница с другими лабораториями в цене 2 раза (!). Хорошая экономия получается в наших условиях. Результаты очень быстро получила на электронку. Также понравился сам медцентр — очень красивый и уютный. Сотрудники приветливые и грамотные. Буду всем рекомендовать. Наташа

От всей души хочу поблагодарить сотрудников за грамотную консультацию и качественный результат анализов. В поликлинике поставили гепатит С, за два дня чуть не поседела. Пришла в центр диагностики. Успокаивали всем коллективом, что быают ошибки и положительно-ложные результаты. Печаль в том, что год назад сделала татуировку, поэтому исключить заражение не могла. Да и вопрос не в том, что где-то кто-то ошибся, а в человеческом отношении. Результат, кстати, отрицательный. Не знаю, как у нас проверяют, но доверия больше нет.

Уважаемая Елена!
В нашем центре анализы принимаются в течение всего рабочего дня, все дни недели согласно действующему расписанию. Но, по Инструкции по отбору и хранению первичных проб, утвержденной заместителем директора ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в лаборатории которого проводятся все исследования, существуют определенные ограничения по срокам хранения биобпроб, поэтому те анализы, которые должны быть доставлены в лабораторию в течение 24 часов, соответственно принимаются в день отправки до прихода курьера. Биоматериал (кровь, моча, кал, мазки и соскобы) для исследования забирается в специальные пробирки-контейнеры с соответствующими реагентами-стабилизаторами, сроки и условия хранения биопроб изложены в указанной выше инструкции и специалистами нашего офиса строго соблюдаются, что постоянно контролируются специалистами лаборатории.
Результаты выполненных исследований направляются, по желанию пациента, на указанный электронный или почтовый адрес, кроме того, все результаты можно по персональному коду (указан в договоре) посмотреть на сайте CMD, и распечатать самостоятельно.
Надеемся, что в дальнейшем, при изменении расписания самолетов в Москву, мы сможем увеличить время приема анализов. Так же информируем Вас, что в ближайшее время открывается второй офис Центра молекулярной диагностики по адресу ул. Лобова, дом 4, с просторными холлами и большой регистратурой.

В целом весьма средненько
Ресепшн очень маленький, пациенты стоят кучей (есть только один небольшой диван, куда можно присесть). Всё слышат про других, естественно, кто что от чего сдает. Никакой врачебной тайны. По телефону не всегда культурно и грамотно отвечают по поводу цен, сроков и порядка сдачи анализов.
Прием анализов для отправки только понедельник, среда, пятница…ещё и до 10 утра, т.е. остальные анализы где-то киснут
Ответы анализов можно заказать по электронной почте, но вот мне ничего не прислали, пришлось названивать и только после 3-го(!) звонка мне соизволили прислать результаты, которые из-за позднего времени уже не удалось нигде распечатать, так что пришлось переписывать от руки и так нести к врачу.
Цены — почти как везде, в других лабораториях. Берут анализы на многие вещи.
Но вот, перевязку делают обычным лейкопластырем, а ведь есть специальные эластичные бинты даже телесного цвета. То есть на расходных материалах, наверное, экономят
Да…и никакого УЗИ там нет,так что предыдущий оратор наверное с МДЦ перепутал

Мы всей семьей, в том числе маленькие дети, уже не первый год пользуемся услугами ЦМД, анализы в основном, по беременности делала УЗИ. Лично меня все устраивает, есть с чем сравнить…например Инвитро — вот после них точно нужно перепроверять, результаты через раз неверны. ЦМД хорошая лаборатория, берут кровь просто замечательно, мазки тоже сдавала, никаких проблем, все аккуратно и быстро. Время исполнения обычно быстрее, чем указано, что тоже приятно. Персонал вежливый, на все вопросы отвечают. Цены ниже, чем во многих дркгих клиниках.
Вообщем не надо наговаривать. А если, не нравится что-то, то клиник достаточное количество…
Надеюсь, что ЦМД и дальше будет соответствовать высокому уровню!
Желаю успехов!!!

00Elin, 17 июля 2014 #35

А у меня другое мнение. Пусть пациенты знают к чему готовиться. Кому не нужна такая информация — не обращайте внимание. Мне был бы полезен такой отзыв в своё время.

Вот в кои-то веки согласна с Зильбельтрудом! У клиники есть свой сайт и отзывы с ТАКИМИ подробностями лучше оставлять там, а никак не на обозрение всего Мурманска и области. ..

01Elin, 16 июля 2014 #33

Этот центр мне посоветовал мой врач. Результаты не проверяла в других клиниках. Нареканий по поводу анализов нет. Персонал вежливый. Всегда отвечает на мои вопросы чётко и понятно. Огромное замечание по поводу лаборанта, берущего мазок. Сегодня она меня намучила! !! Человек несколько минут не мог вставить зеркало. Пока вставляла несколько раз меня внутри поцарапала. Я думала, что девушка — лаборант взяла несколько мазков. Спросила. Говорит нет, ещё не взяла. Зеркало, мол, неудобное. Мне может со своим приходить? Руководство, примите меры. Пожалуйста, проверьте, может, действительно что-то с инструментами? Я спросила у администратора, давно ли лаборант работает. Мне ответили, что давно. Моё личное впечатление, что первый день. Мне абсолютно не нужны проблемы по гинекологии. И царапания во время взятия анализа быть не должно! Раньше как-то нормально брали! Сама девушка была очень вежлива. Очень прошу cmd ответить на мой комментарий. Руководство прошу разобраться, инструменты не подходящие или персонал с руками не из того места. Жду ответа. Спасибо.

00CMD51, 13 февраля 2014 #32

Зильбельтруд! Право выбора клиники за вами, но всегда ли хорошо, когда на вас плюют! Анализы в НИИ делают качественно.Поверьте, врачам есть чем заняться, кроме как «приукрашивать» анализы.Опять же от «приукрашенных» анализов для лаборатории выгода ноль.

00CMD51, 13 февраля 2014 #31

Sandrink! Лаборатория несет полною ответственность за результаты анализов, так как она располагается на базе НИИ эпидемиологии!К слову о проверках: если у вас возникают спорные вопросы по результатам анализов мы отправляем все запросы в лабораторию, где собирают консилиум и дают письменное заключение по вашему случаю. Вы, насколько я знаю с этим вопросом к нам не обращались, поэтому не вижу подтверждения ваших обвинений. Мы работаем на честной, медицинской основе, про историю НИИ и его руководителей, вы можете почитать на сайте http://www.cmd-online.ru.
А по-поводу гос или частных клиник- это ваш выбор!

00admin, 13 февраля 2014 #30

Уважаемый посетители Ритон, Bomba, Mor4444, maroko! Мы удалили Ваши сообщения так как расценили их, как поклёп и нанесение вреда репутации заведения. Аккаунты были зарегистрированы одним лицом.

Зильбельтруд, да вы же не в курсе)))))) Я прекрасно понимаю предыдущий пост. Сама сталкивалась с ситуацией когда приходилось обращаться в платные клиники для сдачи крови, и всё это потому, что в гос.больницах нет оборудования или реактивов. Неужели вы думаете, что мы бы добровольно отдавали очень большие деньги за сомнительные услуги, если бы нам давали выбор? К сожалению даже в МДЦ врачи зачастую дают направление со словами «К сожалению, сейчас у нас вам этот анилиз не сделать, ищите платные клиники».

Это ж каким надо быть наивным глупцом, чтобы обследоваться в частных клиниках? Непредвзятое отношение к выделениям вашего организма только в государственных поликлиниках — там на вас плевать хотели, и никто не будет приукрашивать результаты анализов. Этим можно и нужно пользоваться, делая из баклабораторий больниц и поликлиник независимых экспертов.

00За лабораторией CMD приходится проверять анализы

Я больше не верю специалистам из CMD, анализ мочи у грудничка все четыре раза в этой лаборатории был просто ужасный. В конце концов, не выдержали и разделили материал на три контейнера, во всех других лабораториях, кроме CMD результат просто отличный, а у них одна патология, по-видимому, в мозгах у персонала…

Добрый вечер!подскажите можно ли у вас сделать анализ спермограммы?если можно,укажите стоимость этой услуги.

Катерина, 30 сентября 2012 #25

Скажите пожалуйста, в вашей лаборатории делают анализы на микрофлору и кандидоз, из зева?

cmd, 12 сентября 2012 #24

Здравствуйте, в нашем центре работает гинеколог- женщина. Записаться на приём можно ежедневно по тел. 58- 77- 68

Алена, 31 июля 2012 #23

Подскажите пожалуйста, у вас гинеколог — врач женщина? и за сколько времени можно записаться на прием?

Гемотест, Сеть лабораторий — «Гемотест Гемотесту рознь! Но какие же чучундры работают в нашем районном отделении!»

Гемотест удобно расположился в нашем же доме. Ребенку, да иногда и сама, много раз сдавали анализы там. Уже давно имею карточку с максимальной скидкой. Вроде как он много раз выручал нас. Но и много раз огорчал!

Первый косяк — в обычном клиническом анализе крови всегда повышены показатели «эритроциты» и «средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах». Когда это стало повторяться в анализах грудного ребенка из раза в раз, у меня возникла паника. Появилась даже мысль, что нам надо к гематологу везти ребенка. Педиатр успокаивала меня и говорила, что все нормально, это ж Гемотест… Но я не унималась. Потом в моих анализах такая же была картина. Стало подозрительно. Пошли сдавать в Инвитро и CMD (Центр молекулярной диагностики), где такого нам не написали. Я стала верить педиатру. А потом увидела то же самое в анализе у дочки моей подруги и поняла – скорее всего педиатр была права, что дело в Гемотесте с его супероборудованием и непонятными нормами.

Второй косяк – Гемотест нашел антитела в крови четырехлетнего ребенка к описторхиям. Вот так мы сдали анализ крови на гельминтоз. Кто не знает это показатель инфицирования гельминтами (червями) кошачий сосальщик и сосальщик Виверры, вызывающими заболевание описторхоз. Страшное заболевание на самом деле. Уже поседевшая и несколько ночей не спавшая я побежала к инфекционисту со всеми нашими анализами. На что она очень удивилась и просила следить за повышением эозинофилов, самочувствием ребенка и конечно же пересдать анализ в другой лаборатории, потому что очень часто бывают ложноположительные реакции. CMD антител не обнаружил, да и по анализу кала тоже всегда было все чисто. Начитавшись уйму информации я до сих пор не спокойна, потому что верить уже не знаю кому и часто задумываюсь о том, что подтвердить описторхоз простыми анализами очень трудно. Когда однажды у ребенка повысились эозинофилы на фоне аллергии, о которой мы еще и не подозревали, я так волновалась. Не передать словами! Не знаю, буду ли я теперь спокойна когда либо… И вот третий косяк ну просто добил меня. Ребенку предстояла аденотомия. Мы собирали анализы на госпитализацию и операцию. Пришли в Гемотест. Сдать надо было много самых различных анализов. Один из самых сложных для Гемотеста оказалось определить время кровотечения и время свертывания. Оплату на кассе сразу не взяли. Сказали посмотрим получится ли взять у ребенка кровь. Не знаю, может я не права, но считаю, что за наши деньги должны уметь всё делать. Я не понимаю как можно стоять в очереди, потом 15 минут оформляться, и еще нет гарантии смогут ли в платной лаборатории взять у ребенка анализов на 7 тысяч… Наша Раша…Так вот в кабинете началась такая песня! Что плакал не только мой ребенок, но и я — тридцатилетняя тетка. Такой был для нас стресс! Вот думаю теперь, что тогда надо было встать и уйти! Но я переживала из-за предстоящий операции. Итак, зашли мы с ребенком в кабинет. Медсестра (в нашем Гемотесте как всегда нерусская), что работала в этот день нам была не знакома. Посмотрев наши направления, начала изрядно волноваться. Что-то долго суетилась и ходила по кабинету, расставляя какие-то медицинские предметы. Мы сидим. Напряжение явно растет. Хотелось сказать, что желательно приступить бы, ведь мне на работу еще ехать, но сдержалась, чтобы ее не злить. Кровь мы еще не сдали, но в Гемотесте я потратила уже 45 минут. Тут видимо, у них так принято, она взялась знакомиться с моим ребенком. Цель была, как я поняла, его успокоить. Но у четырехлетнего ребенка начиналась паника, он знал, где мы находимся и что обычно здесь происходит. Нам бы взять кровь без всяких прелюдий. Ребенок с тетей явно не хотел знакомиться, но она НАСТАИВАЛА. Объяснив ей, что ребенок изрядно устал уже ждать и очень нервничает, знакомиться сейчас натощак с ней не настроен. Она продолжала. Еще раз повторюсь, видимо так требуется у Гемотеста. Начала спрашивать у ребенка ходит ли он в сад и нравится ли ему там. Сад мы не любим и из-за болезни не были там несколько месяцев. Ребенок окаменел и побледнел. Мне не на шутку стало страшно за него. Я не выдержала и попросила приступать или же мы уходим. Пять минут, чтобы раскачаться медсестре по-моему достаточно! Приготовив все необходимые пробирки, иголки, и таймер для расчета времени кровотечения и свертывания, в котором она долго тыкала одни и те же кнопки, она берет руку у ребенка. Мне показалось, что она впервые измеряет эти показатели и вообще держит этот таймер… Я помогаю держать ребенка, т. к. он начал вырываться и плакать. Она делает прокол и в это время надо было включить таймер, но она тыкнула куда не туда, таймер не включился, а время идет! Ребенок заливается, кровь бежит. Она бросив таймер, побежала к свой сумке и достала айфон!!! Начала причитать и искать таймер в смартфоне. Я в ауте, уже понимаю анализ коту под хвост…Начала вроде как брать анализ из вены в пробирку. Ребенок кричит по полной программе и я вижу, что человек просто крик не выносит. Ну есть такие люди — паникуют при плаче. И говорит мне «пусть он замолчит!» Ага, сейчас кнопку нажму (на твоем айфоне…) И вы представляете этот грязный чугунный айфон она трогает в перчатках, потом берется за руку ребенка, которую только что продезинфицировала. Начала моего ребенка уговаривать замолчать, даже ладонью рот ему прикрыла. Потом не выдержала и позвала с ресепшена помощь. Пришла такая же по национальности медсестра с золотыми зубами и быстро начала брать кровь из вены у моего ребенка вообще без перчаток. А ведь она только что оформляла клиента и принимала от него деньги! Такого омерзения я еще не испытывала. Зато быстро…Та вообще отказалась брать кровь, ссылаясь, что она так не может (Как так? Когда ребенок плачет?)И она спрашивает медсестру ты таймер то выключила, кровь уже остановилась и свернулась, а таймер то все считает?! Ушли мы от туда оба плача, трясущиеся и все потные, спасибо говорить мне не хотелось. Народу в коридоре собралось ну очень много Короче от балды мне написали цифры… Естественно хирург развернул нас с этим анализом обратно пересдавать. Это было дело в Гемотесте Свиблово, что на Снежной улице. Пересдавать мы поехали в Медведково, в других лабораториях такой анализ не проводят. В Медведково нас обслужили на высшем уровне, взяли и посчитали все спокойно на моих глазах по этому таймеру, все зафиксировали вовремя. В общем, оставили о себе очень приятное впечатление. Но Свибловское отделение это что-то! Как-то раз оформляясь на репешене, они грубо отказали отцу взять анализ у младенца, т. к. малыш час назад кушал. И так отшили мужчину, что думаю он вообще больше в Гемотест ни ногой. Как можно принести натощак месячного грудничка не понятно, могли бы вежливо попросить погулять час после еды. Естественно мужчина высказался и все получили порцию негатива. А теперь я думаю, а не отказали ли они, потому что просто не умеют??? В общем, я стараюсь туда не ходить больше, но однажды лень было везти ребенка на анализ, поликлиника у нас очень далеко. И я предварительно проверив не та ли медсестра принимает сегодня, согласилась сдать ребенку кровь здесь поближе к дому как говориться. Тем более из пальца проще не куда. И очень удивилась. Медсестра была в ту смену высшего пилотажа. Она также начала с ним знакомиться, также спрашивать про сад, но как то у нее это классно получалось, игриво, ловко так! Ребенок и не заметил как палец был уже проколот и кровь вовсю забиралась. А они все болтали и болтали. В общем, она умничка большая, теперь я знаю что можно без слез сдать кровь. Жаль таких медсестер очень мало. А на ту нелепую недотепу нарвалась моя племянница. Она вообще сдавала гинекологические мазки. Медсестра вставила зеркало ей и ушла из кабинета на пять минут. Племянница высказала, что так нельзя и что ей очень неприятно такое обращение с ней. Но та с ней разговаривал по-хамски. Теперь племянница не ходит даже кровь из пальца туда сдавать. Ну а последний раз меня удивили на ресепшене. У меня не спросили дисконтную карту. Хотя я ее положила в лоток для денег, вместе с деньгами. Просто сотрудница пустила расчет на печать и вручила мне на подпись договор. Я спрашиваю, что это уже со скидкой посчитали? Просто мне показалось подозрительно, обычно всегда спрашивают имеется ли у меня дисконтная карта, и вообще мне показалась она ее видела и учла. Ведь я тоже отвлекалась на ребенка и могла не увидеть это. В результате она мне заявляет, что я ей не сказала о имеющейся карточке. Мне уже порядком надоели их постоянные ошибки и отвратное обслуживание. Ведь везде, во всех магазинах и даже у них всегда так было — на ресепшене спрашивают о дисконтной карте первые. И выставила меня виноватой, повторив это несколько раз. Я укоризненно на нее посмотрела, ну что ей сказать? Все и так с вами ясно, наверное из регистратуры пришли… Да, в Гемотест может быть придется сходить не раз, но мое мнение сейчас о них не самое лучшее. Я ставлю Гемотесту «ДА», но оценку им двояк! Им совершенствоваться и совершенствоваться еще, а особенно тщательно персонал подбирать надо.

Миопатия врожденная. Поиск мутаций в гене ITGA7, м. (Congenital Muscular Dystrophy, CMD, Gene ITGA7, Mut.)

Исследуемый материал Цельная кровь (с ЭДТА)

Метод определения

Секвенирование.

Выдаётся заключение врача-генетика!

Исследование мутаций в гене ITGA7.

Тип наследования.

Не установлен.

Гены, ответственные за развитие заболевания.

ITGA7 (INTEGRIN ALPHA-7) — ген α7-интегрина, расположен на хромосоме 12 в регионе 12q13.

Определение заболевания.

Одна из форм врожденных мышечных дистрофий.

Патогенез и клиническая картина.

Интегрины – обширное семейство гетеродимерных мембранных гликопротеинов, которые принимают участие в широком спектре межклеточных взаимодействий. Их свойство участвовать в процессах клеточной адгезии лежит в основе многих их функций. Интегринам отведена значительная роль в клеточной миграции, тканевом развитии, дифференцировке и метаболизме. Экспрессия гена α7-интегрина (ITGA7) отмечена главным образом в скелетных и сердечных мышцах и может быть вовлечена в процессы дифференцировки и миграции во время миогенеза. Дефекты гена ITGA7 ассоциированы с врожденной миопатией. Заболевание начинается в перинатальном периоде. Характерна задержка темпов раннего моторного и психо-речевого развития. При тяжелом течении заболевания больные никогда самостоятельно не сидят и не ходят. При умеренно выраженном прогрессировании болезни больные передвигаются самостоятельно. При этом походка носит характер «утиной» и сходна с таковой при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна.

При подъеме из положения на корточках больные используют приемы Говерса. Для больных характерна умственная отсталость, в большинстве случаев их словарных запас ограничен несколькими словами. Активность сывороточной креатинкиназы умеренно повышена. Биопсия мышц показывает изменения структуры, характерные для врожденной миопатии (жировое перерождение и изменение размеров мышечных волокон).

Частота встречаемости: не определена.

Перечень исследуемых мутаций может быть предоставлен по запросу.

Литература

Кеннет Л. Джонс «Наследственные синдромы по Девиду Смиту» Атлас-справочник. Москва, Практика, 2011.
Козлова С. И., Демикова Н. С. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. – М.: КМК, 2007 – 448 с.
К.Д. Краснопольская «Наследственные болезни обмена веществ. Справочное пособие для врачей». М., 2005 г.
Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В. В. Молекулярная неврология — Заболевания нервно-мышечной системы. М. 2000 г.
Nakashima, H., Kibe, T., Yokochi, K. Congenital muscular dystrophy caused by integrin alpha-7 deficiency. (Letter) Dev. Med. Child Neurol. 51: 245 only, 2009.
Nakashima, H., Kibe, T., Yokochi, K. Congenital muscular dystrophy caused by integrin alpha-7 deficiency. (Letter) Dev. Med. Child Neurol. 51: 245 only, 2009.
OMIM

Воспользуйтесь страницой поиска анализов, и сможете узнать где выполняются, необходимые вам медицинские исследования, а так же сравнить цены.

↓ Показать ещё↓

Это не весь список лабораторий и медицинских учреждений!

Пожалуйста, уточните ваш адрес или воспользуйтесь поиском по анализам.

Печать заказа

На этой странице вы сможете найти ближайшие от вас медицинские лаборатории или учреждения. В нашей базе есть информация по более 2500 медицинским центрам предоставляющим диагностические услуги, среди которых вы сможете найти как крупные компании, как лаборатория Инвитро, Гемотест, CMD, KDL, Helix и Ситилаб, так и средние и небольшие компании, как лаборатория Диалаб, Литех, Ниармедик, диагностические центры МРТ-Эксперт, Медэксперт и многие другие. Вы всегда можете воспользоваться картой, расположенной выше, которая укажет Вам, как добраться до интересующей Вас медицинской лаборатории или медцентра, а так же получить контактные данные и время работы.

Вы также можете воспользоваться нашим поиском по диагностическим услугам, чтобы узнать, выполняются ли те или иные анализы в нужной Вам лаборатории, или просто найти удобную для Вас медицинскую лабораторию, где вы сможете выполнить необходимые исследования.

Краниометафизарная дисплазия, ANKH м. — цена анализа в Ереване в ИНВИТРО

Метод определения Секвенирование

Исследование мутаций в гене ANKH.

Тип наследования.

Аутосомно-доминантный.

Гены, ответственные за развитие заболевания.

Ген гомологичный мышиному гену прогрессирующего анкилоза (ANK, MOUSE, HOMOLOG OF) расположен на хромосоме 5 в регионе 5p15.2 .

Мутации в данном гене приводят также к развитию хондрокальциноза 2-го типа (псевдоподагра).

Определение заболевания.

Краниометафизарная дисплазия или черепно-метафизарная дисплазия — остеохондродисплазия, характеризующаяся гиперостозом и склерозом черепно-лицевых костей и расширением метафизов. Часто данное заболевание принимают за болезнь Пайла (множественную метафизарную дисплазию), однако при краниометафизарной дисплазии наблюдается более выраженный гиперостоз черепа и меньшее расширение метафизов.

Патогенез и клиническая картина.

У мышей ген ANKH кодирует мембранный переносчик пирофосфата – главного ингибитора обызвествления и резорбции костной ткани.

В грудном возрасте образуются бугры в околоносовой области, а также прогрессирующее расширение и утолщение костей черепа и нижней челюсти, что приводит к деформации лица и челюсти. Деформированные кости ущемляют черепные нервы, вызывая их дисфункцию. Нарушение прикуса может быть проблематичным; частичная облитерация пазух предрасполагает к рецидивирующим инфекциям верхних дыхательных путей. Рост и здоровье в целом нормальные. Редким и тяжелым осложнением является прогрессирующее повышение внутричерепного давления.

Радиографические изменения зависят от возраста и обычно очевидны к 5-летнему возрасту. Склероз является главным признаком изменений со стороны черепа. В длинных костях отмечается расширение метафизов, что выглядит как булавовидные расширения, особенно в области дистальных отделов бедренных костей, Х-образное искривление ног. Тем не менее, эти изменения значительно менее выражены, чем при болезни Пайла. Позвоночник и кости таза не поражаются.

Описаны две формы краниометафизарной дисплазии:

С аутосомно-доминантным типом наследования. Данная форма болезни протекает довольно легко, и с возрастом характерные черты лица сглаживаются, симптомы обычно сводятся к последствиям сдавления черепных нервов (особенно лицевого и преддверно-улиткового), а иногда ограничиваются только склерозом черепных швов. При данной форме выявляются мутации в гене ANKH.
С аутосомно-рецессивным типом наследования. Характерные черты лица с возрастом усиливаются, ухудшается зрение, нарастает тугоухость, нарушается прикус, развивается парез мимических мышц, иногда возникает атаксия, обратимая после декомпрессии задней мозговой ямки. Для данной формы молекулярная диагностика не проводится.

Частота встречаемости: не установлена. Заболевание редкое.

Перечень исследуемых мутаций может быть предоставлен по запросу.

Литература

Кеннет Л. Джонс «Наследственные синдромы по Девиду Смиту» Атлас-справочник. Москва, Практика, 2011.
Beighton, P. Craniometaphyseal dysplasia (CMD), autosomal dominant form. J. Med. Genet. 32: 370-374, 1995.
OMIM.

ТЕРМИНЫ / СОКРАЩЕНИЯ — CMD Fertility

* термины, которые вы можете услышать в медицинском кабинете и не уверены, что они означают *

ЯЙЦО в сравнении с ЭМБРИОНОМ:

Яйцо находится в фолликуле, фолликул присутствует в яичнике, и фолликулы извлекаются во время ПОВТОРЕНИЯ ЯЙЦА

Эмбрион — оплодотворенное яйцо — во время ЭКО эмбрион имплантируется в матку во время ПЕРЕДАЧИ ЭМБРИОНА

ABO / Rh —

AH (Assisted Hatching) — лабораторный метод , который был разработан, когда эксперты по фертильности обнаружили, что эмбрионы с тонкой блестящей оболочкой имеют более высокий процент имплантации во время ЭКО. При вспомогательном вылуплении эмбриолог с помощью микроманипуляции под микроскопом создает небольшое отверстие в блестящей оболочке.

AFC — количество антральных фолликулов

AMH — антимюллерова гормон Тест на фертильность дает оценку оставшегося запаса яйцеклеток или овариального резерва

ART — Вспомогательные репродуктивные технологии — это технология, используемая для достижения беременности при таких процедурах, как лечение бесплодия, экстракорпоральное оплодотворение и суррогатное материнство.Это репродуктивная технология, используемая в основном для лечения бесплодия, также известная как лечение бесплодия.

ASRM — Американское общество репродуктивной медицины

Бактериальный вагиноз — — инфекция во влагалище . BV вызывается изменениями количества определенных типов бактерий во влагалище. БВ — обычное дело, и любая женщина может заразиться им. БВ легко поддается лечению лекарствами от врача или медсестры.Если его не лечить, он может повысить риск заражения инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП), и вызвать проблемы во время беременности.

Базовый уровень — позвонив нам в первый день менструации и позвонив по номеру перед началом приема лекарств , вы запишетесь на прием для УЗИ и анализа крови

BID — два раза в день

Бластоциста — эмбрион, который развился в течение пяти-семи дней после оплодотворения и имеет 2 различных типа клеток и центральную полость, заполненную жидкостью (полость бластоцеля). Клетки в бластоцисте только начали дифференцироваться.

CA 125 —

CDC — Центры по контролю и профилактике заболеваний

CGH —

Cmd 1 — после нескольких дней стимуляции , вы запишетесь на прием для УЗИ и анализа крови

Код CPT —

Криоконсервация эмбрионов — это процесс сохранения эмбриона при отрицательных температурах, как правило, на стадии эмбриогенеза, соответствующей преимплантации, то есть от оплодотворения до стадии бластоцисты

Мониторинг цикла — записи на УЗИ и анализы крови во время стимуляции / цикла лечения, чтобы убедиться, что все идет в соответствии с планом цикла / ожиданиями, чтобы при необходимости можно было внести необходимые изменения

Муковисцидоз — Муковисцидоз — это прогрессирующее генетическое заболевание, которое вызывает стойкие инфекции легких и с течением времени ограничивает способность дышать.

D&C — разбавление и выделение

Внематочная беременность — Беременность, при которой оплодотворенная яйцеклетка имплантируется вне матки.

Яйца — хранятся в фолликулах яичника. … Однако, несмотря на то, что сотни яиц начали созревать, чаще всего только одна яйцеклетка становится доминирующей во время каждого менструального цикла и достигает своего полностью зрелого состояния, способного к овуляции и оплодотворению. Оставшиеся яйца / фолликулы засохнут и умрут

Донор яйцеклеток — известный или неизвестный — молодая женщина передает свои яйцеклетки реципиенту с помощью процедуры ЭКО в обмен на финансовое вознаграждение

Извлечение яйцеклетки — процедура, при которой игла вводится через верхнюю часть влагалища под контролем ультразвука, чтобы добраться до яичника и фолликулов.Жидкость в фолликулах отсасывается через иглу, яйца отделяются от стенки фолликула и отсасываются из яичника

Перенос эмбрионов — это этап в процессе вспомогательной репродукции, на котором эмбрионы помещаются в матку женщины с намерением установить беременность.

Эндометрий — слизистая оболочка, выстилающая внутреннюю часть матки (матки). Эндометрий меняется на протяжении менструального цикла. Он становится толстым и богатым кровеносными сосудами, чтобы подготовиться к беременности.Если женщина не забеременела, часть эндометрия отходит, вызывая менструальное кровотечение.

Биопсия эндометрия — это удаление небольшого кусочка ткани из эндометрия, который является слизистой оболочкой матки. Этот образец ткани может показывать клеточные изменения, вызванные аномальными тканями или колебаниями уровня гормонов.

E2 (эстрадиол) — стероид, эстроген и основной женский половой гормон. Он назван в честь и играет важную роль в регулировании полового цикла и менструального цикла женщины.Эстрадиол необходим для развития и поддержания женских репродуктивных тканей, таких как грудь, матка и влагалище, в период полового созревания, взросления и беременности, но он также имеет важные эффекты во многих других тканях, включая кости, жир, кожу, печень и мозг.

Фаллопиевы трубы — также известные как маточные трубы или сальпинги (сингулярный сальпинкс), представляют собой две очень тонкие трубы , выстланные реснитчатым эпителием, ведущие из яичников самок млекопитающих в матку через соединение маточных труб.Маточная труба (маточная труба ) переносит яйцеклетку от яичника к матке. Если биологическая аномалия, хирургическое вмешательство или внематочная беременность не привели к потере одной трубки , женщины должны иметь в своем теле две маточные трубки .

Флюидное ультразвуковое исследование (FUS) — или соногистерография — это особый вид ультразвукового исследования . Жидкость вводится в матку через шейку матки с помощью тонкой пластиковой трубки. Затем звуковые волны используются для создания изображений слизистой оболочки матки.Жидкость помогает показать больше деталей, чем когда используется только УЗИ .

Фолликул — фолликул яичника представляет собой заполненный жидкостью мешок, содержащий незрелую яйцеклетку или ооцит. Эти фолликулы находятся в яичниках. Во время овуляции из фолликула выходит зрелая яйцеклетка.

Перенос замороженных эмбрионов (FET) — это цикл, в котором замороженные эмбрионы из предыдущего цикла свежего ЭКО или цикла донорских яйцеклеток размораживаются, а затем переносятся обратно в матку женщины.Вероятность замораживания эмбрионов во многом зависит от возраста.

FSH — гонадотропин, гликопротеиновый полипептидный гормон. ФСГ синтезируется и секретируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза и регулирует развитие, рост, половое созревание и репродуктивные процессы организма. ФСГ и лютеинизирующий гормон (ЛГ) работают вместе в репродуктивной системе.

Скрининг генетического носителя — Многие генетических заболеваний являются рецессивными, то есть болезнь вызвана унаследованием мутации в одном и том же месте ДНК от обоих родителей. Если родитель несет мутацию в одной из двух копий ДНК, он / она является носителем генетического заболевания . Если и вы, и ваш партнер являетесь носителями такого заболевания, как муковисцидоз, серповидно-клеточная анемия или болезнь Тея-Сакса, ваш ребенок будет иметь 1 из 4 шансов унаследовать один дефектный ген от каждого из вас и родиться с этим заболеванием.

Гестационный суррогат — женщина, вынашивающая плод для предполагаемых родителей до полного срока

HCG — хорионический гонадотропин человека — гормон, вырабатываемый во время беременности .Он состоит из клеток, образованных в плаценте, которая питает яйцеклетку после того, как она была оплодотворена, и прикрепляется к стенке матки.

HCT —

ВПЦ —

HGB —

HE4 —

HPT — домашний тест на беременность

HSC-гистероскопия

HSG / Гистеросальпингограмма — рентгеновский тест. Он исследует внутреннюю часть матки и маточных труб и область вокруг них. Часто это делается для женщин, которым трудно забеременеть (бесплодие).Во время теста краситель (контрастное вещество) пропускается через тонкую трубку. Эта трубка вводится через влагалище в матку. Поскольку матка и фаллопиевы трубы соединены вместе, краситель будет течь в маточные трубы. Снимки делаются с использованием постоянного луча рентгеновского излучения (рентгеноскопия), когда краситель проходит через матку и фаллопиевы трубы. На снимках могут быть показаны такие проблемы, как травма или аномальное строение матки или маточных труб. Они также могут показать закупорку, которая не позволяет яйцеклетке перемещаться по маточной трубе в матку.Закупорка также может препятствовать проникновению сперматозоидов в маточную трубу и соединению (оплодотворению) яйцеклетки. Тест также может выявить проблемы внутри матки, которые препятствуют прикреплению (имплантации) оплодотворенной яйцеклетки к стенке матки.

H&P — история и физический

МКБ 10 —

ICSI — Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов — это процедура экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при которой один сперматозоид вводится непосредственно в яйцеклетку

ИМ —

IUI — внутриматочная инсеминация — лечение бесплодия, при котором в матку женщины помещают сперму для облегчения оплодотворения. Цель ВМИ — увеличить количество сперматозоидов, попадающих в маточные трубы, и впоследствии повысить вероятность оплодотворения

ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение — Экстракорпоральное оплодотворение — это вспомогательная репродуктивная технология (ВРТ), обычно называемая ЭКО . ЭКО — это процесс оплодотворения путем извлечения яйцеклеток, получения образца спермы, а затем ручного объединения яйцеклетки и спермы в лабораторной посуде. Затем эмбрион (ы) переносится в матку.

LH — гормон, вырабатываемый гипофизом. ЛГ помогает регулировать менструальный цикл и производство яиц (овуляцию). Количество ЛГ в организме женщины зависит от фазы ее менструального цикла. Этот гормон быстро повышается прямо перед овуляцией, примерно в середине цикла (14-й день 28-дневного цикла). Это называется выбросом ЛГ. Уровни лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона повышаются и падают одновременно в течение месячного цикла

MET (имитация переноса эмбрионов) — «Имитация» переноса эмбрионов — это пробный запуск фактического переноса эмбрионов. Это позволяет врачу определить лучший «маршрут» к идеальному месту посадки эмбриона в вашей матке, измерить длину от шейки матки до этого идеального места и убедиться, что на этом пути нет неожиданных неровностей (например, необнаруженная миома, рубцовая ткань на шейке матки или другая проблема, которая может затруднить перенос).

Морфология — размер и форма сперматозоидов

Подвижность — движение / направление сперматозоидов

Natural IUI — (нестимулированная) внутриматочная инсеминация ( IUI ) означает, что вы проходите процедуру без использования препаратов для регулирования или запуска овуляции (стимулированная / медикаментозная IUI )

Ооцит — Ооцит — незрелая яйцеклетка (незрелая яйцеклетка)

Отчет об оценке яичников — предоставляет наиболее точную доступную оценку овуляторного яйцекладки женщины с использованием одного образца крови (E2, FSH, LH, Inhibin B, AMH, протестированные вместе)

Синдром гиперстимуляции яичников (OHSS ) — заболевание, поражающее яичники некоторых женщин, которые принимают лекарства от бесплодия для стимуляции роста яйцеклеток. В большинстве случаев заболевание протекает в легкой форме, но редко состояние тяжелое и может привести к серьезному заболеванию или смерти.

Индукция овуляции — стимуляция овуляции лекарствами. Обычно он используется в смысле стимуляции развития фолликулов яичников для отмены ановуляции или олиговуляции, но также может использоваться в смысле запуска высвобождения ооцитов из относительно зрелых фолликулов яичников.

PGS — Преимплантационный генетический скрининг — генетическое тестирование на эмбрионах

PGD — Преимплантационная генетическая диагностика — генетическое тестирование эмбрионов на определенное заболевание

PPI — инструкции после беременности

Предварительные лабораторные работы (PCLW) — лаборатории / тесты, которые необходимо завершить перед началом лечения ЭКО / ВМИ

P4 — Прогестерон — гормон , который вырабатывается в яичниках, плаценте (при беременности женщины) и надпочечниках. Он помогает подготовить ваше тело к зачатию и беременности и регулирует ежемесячный менструальный цикл.

краснуха —

RPR — Сифилис

QD — 1 раз в сутки

QHS — ночью

SA / SE (анализ спермы / оценка спермы) — тестирование спермы, оценивающее определенные характеристики мужской спермы и содержащейся в ней спермы. Это делается, чтобы помочь оценить мужскую фертильность, будь то для тех, кто хочет забеременеть, или для проверки успешности вазэктомии.

SART — Общество вспомогательных репродуктивных технологий

SHG — соногистограмма / УЗИ жидкости

Серповидная клетка — группа заболеваний крови, обычно передаваемых по наследству от родителей. Наиболее распространенный тип известен как серповидно — клеточная анемия (SCA). Это приводит к нарушению содержания кислорода в белке гемоглобине (гемоглобине S), обнаруженном в клетках красной крови .

SMA —

Соногистерография — особый вид ультразвукового исследования . Жидкость вводится в матку через шейку матки с помощью тонкой пластиковой трубки. Затем звуковые волны используются для создания изображений слизистой оболочки матки. Жидкость помогает показать больше деталей, чем когда используется только УЗИ .

Количество сперматозоидов — описывает концентрацию сперматозоидов в эякуляте

Промывка спермы — процесс, при котором отдельные сперматозоиды отделяются от семенной жидкости. Промытая сперма используется при искусственном оплодотворении с использованием техники внутриматочной инсеминации (ВМИ) и при оплодотворении in vitro (ЭКО).

ЗППП — инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (ВИЧ ½, Hep BSaG, Hep C AB, RPR / VDRL, HTLV I / II)

Хирургический центр Тихого океана — хирургический центр Санта-Моники, ориентированный на пациентов, где доктор ДеУгарте выполняет большинство своих операций. Звоните: (310) 576-7267

SQ —

TESE — Извлечение сперматозоидов из яичка — это процесс удаления небольшой части ткани из яичка под местной анестезией и извлечения нескольких жизнеспособных сперматозоидов, присутствующих в этой ткани, для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ).

TID — 3 раза в сутки

TSH — гормон, который обычно используется в качестве маркера здоровья щитовидной железы

Ультразвук — мы используем трансвагинальное УЗИ — вид УЗИ органов малого таза, используемый врачами для исследования женских репродуктивных органов. Это включает матку, маточные трубы, яичники, шейку матки и влагалище.

Матка , широко известная как матка, представляет собой полый мышечный орган женской репродуктивной системы, который отвечает за развитие эмбриона и плода во время беременности.

Ветряная оспа —

VDRL — Сифилис

Дрожжевые инфекции — Вагинальные дрожжевые инфекции вызываются грибком Candida albicans. По крайней мере, 3 из 4 женщин в какой-то момент своей жизни переживут грибковую инфекцию . Основные симптомы — зуд, жжение, необычные выделения и боль во время мочеиспускания или секса.

ZIKA — инфекция, передаваемая комарами, которая впервые была выявлена в Африке в 1947 году.С момента первого зарегистрированного случая в Бразилии в 2015 году он значительно распространился по миру.

Зигота — оплодотворенная яйцеклетка, полученная в результате соединения женской гаметы (яйцеклетки или яйцеклетки) с мужской гаметой (спермой)

CMD Fertility — FertilityIQ

Каким был ваш опыт общения с Кэтрин ДеУгарте в CMD Fertility?

Я доставил в CMD два нормальных эмбриона, протестированных с помощью PGS, для проведения процедуры переноса замороженных эмбрионов (FET). Врач имплантировал оба моих эмбриона за пределами «окон имплантации».Эта ошибка сделала невозможным выживание эмбрионов. Два потерянных нормальных эмбриона, прошедших тестирование на PGS, были оплодотворены из моей 39-летней яйцеклетки. После неудач FET я прошел еще шесть циклов ЭКО, которые не дали нормальных эмбрионов. Я на седьмом цикле. В возрасте 43 лет чрезвычайно сложно получить PGS-нормальные эмбрионы. Врач неоднократно заявлял, что мои неудачи, вероятно, были связаны с тем, что эти эмбрионы были оплодотворены из замороженных яиц. Другие врачи по лечению бесплодия, к которым я консультировался, так как все не согласились с ее оценкой.Они сказали, что время имплантации является решающим фактором успеха. После двух неудач мне сделали ЭКО в ЦМД. На этот раз она сделала анализ рецептивности эндометрия. (ERA) для определения временного «окна имплантации» результат четко показал, что оба предыдущих переноса полевых транзисторов были имплантированы в неправильное время. Эти эмбрионы не давали никаких шансов. По словам других специалистов по фертильности, с которыми я с тех пор консультировался, они сказали, что они настоятельно рекомендовали бы или даже потребовали, чтобы тестирование ERA проводилось ПЕРЕД двумя переводами FET, учитывая мой возраст и ситуацию. Тем не менее, тестирование ERA для двух переводов в CMD не проводилось. Что касается процедуры ERA, которую она, наконец, сделала для следующего ЭКО, в середине процедуры у нее не было навыков, чтобы продолжить, и она попросила медсестру сбежать к соседнему дому, чтобы схватить другого врача, чтобы завершить процедуру за нее.

Какой совет вы бы дали потенциальному пациенту Кэтрин ДеУгарте в CMD Fertility?

По словам других врачей, у меня очень хорошая слизистая оболочка эндометрия, и у меня нет эндометриоза, мои шансы забеременеть при каждом переносе нормальных эмбрионов, проверенных PGS, должны быть очень высокими.Я даже сказал доктору ДеУгарте, что намереваюсь иметь по крайней мере одного ребенка и в идеале надеюсь иметь двух детей от двух эмбрионов. Из-за того, что я выбрала не того врача, я потеряла все и сильно страдала. Ее неправильное лечение причинило мне серьезный ущерб, в том числе мой потенциал иметь биологического ребенка, значительные медицинские расходы после 7 проведенных мной ЭКО, время, а также много боли и эмоционального стресса. Она даст вам номер своего телефона и всегда будет улыбаться, но это не повод выбирать врача.Мой совет — тщательно выбирать и обращать внимание на медицинские знания, навыки и мораль врача. Ей не хватает всех этих качеств. Я считаю ее очень некомпетентной. Сделайте свое исследование, вы найдете ее ок. 4 года рассмотрения дела о врачебной халатности.

Во время лечения с Кэтрин ДеУгарте в CMD Fertility обращались с вами как с числом или человеком?

Я пошел к ней в офис после двух неудачных переводов FET, она посмотрела в свой Instagram и сказала мне, что кто-то разместил своего ребенка на ее странице и попросил меня присоединиться к ее Instagram.Она не упомянула о моей потере. Она была непоследовательна в своих словах, противоречила самой себе и дала неточные медицинские данные. Она обвинила мои эмбрионы в том, что они были оплодотворены из замороженных яиц. После того, как в ходе циклов ЭКО у меня не было нормальных эмбрионов, она сказала, что я правильно поступила, заморозив яйца, когда была моложе. Она имплантировала оба моих тестированных PGS нормальных эмбриона, оплодотворенных из моего замороженного яйца, в неподходящее время. Эта ошибка лишила их возможности выжить.Она была очень не сосредоточена, пропускала медицинские вопросы, но часто говорила о разном. такие вещи, как ее собака, ее кашемировый свитер, ее выходные, ее дети, ее рождественские покупки, беременность других людей и т. д. После того, как я покинул ее клинику и написал ей о своем неудовлетворенном опыте там, она так и не ответила.

Опишите протоколы, которые Кэтрин ДеУгарте использовала в ваших циклах в CMD Fertility, и степень их успеха.

Процедуры FET: Estrace 2 мг в течение 3 недель, гестон 1 куб. См, детский аспирн 81 мг.Оба раза она имплантировала эмбрионы в неподходящее время. Оба раза не удалось ЭКО: Гонал F 300 МЕ, Омнитроп 0,25, Менопур 150 МЕ, Цетротид. Лупрон триггер 4мг и новарел 200МЕ. Начал с 22 фолликулов, 14 извлеченных, 9 оплодотворенных, 4 бластоцист, 0 нормальных PGS.

Расскажите о своем опыте работы с медперсоналом в CMD Fertility.

Во время covid, в 9:30 после моего УЗИ, Джеки сказала мне подождать в аптеке внизу, и как только они откроются в 10:00, она позвонит мне, чтобы я забрал рецепт.Я подождал до 10:30 и позвонил Джеки, она не взяла трубку и не перезвонила, я поднялся к ней в офис в 10:45, она сказала, что не звонила в аптеку, и ей пришлось закончить другую работу, прежде чем она сможет позвонить. В 11 утра она позвонила и сказала, что на этот день они закрыты. Я ждал 1,5 часа зря.

Опишите свой опыт работы с CMD Fertility.

Отметим мое наблюдение: у ее аппарата УЗИ не было возможности самостоятельно записывать размер фолликула в компьютер, медсестра вручную записывала их, а затем вводила в компьютер.Оказавшись без медсестры, я записал для нее информацию. Я пошел к другим врачам и понял, что их машины имеют возможность самостоятельно записывать размер фолликула в систему. Во времена covid ожидание было короче. До covid time время ожидания составляло прибл. От 30 минут до 1 часа 45 минут.

Опишите расходы, связанные с вашим лечением под руководством Кэтрин ДеУгарте в CMD Fertility.

Это очень дорого, одна из самых дорогих клиник в Лос-Анджелесе. После каждого цикла ей требуется повторная встреча, за которую она берет 315 долларов, чтобы продолжить следующий цикл, что также означает пропуск через месяц после каждого цикла.На одной из моих последующих встреч ожидание составило 1 час 45 минут, а разговор — менее 10 минут.

Что конкретно пошло не так в CMD Fertility?

Не удалось позвонить в аптеку по рецептам
Не удалось заказать соответствующий тест
Предоставлена противоречивая информация
Не удалось передать важную информацию

Опишите конкретные вещи, которые пошли не так в CMD Fertility.

2 нормальных эмбриона имплантированы в неправильное время, в результате погибнут оба эмбриона.Из-за нехватки навыков в середине процедуры ERA врач заставила медсестру побежать к соседнему дому, чтобы схватить другого врача, чтобы тот завершил процедуру за нее. Она дала противоречивую, неполную и неточную медицинскую информацию. Медсестра забыла забыть о лекарствах. Врач неправильно диагностировал мой случай и причинил мне много вреда.

Обмен и управление элитной зародышевой плазмой in-vitro для борьбы с болезнью коричневой полосы кассавы (CBSD) и болезнью мозаики кассавы (CMD) в Восточной и Южной Африке

Acedo, Z.В., и Корасон, У. Л. (2008). Быстрое размножение выпущенных филиппинских сортов маниоки через культуру тканей. Журнал корневых культур, 34 (2), 108–114.

Google ученый

Адамс, И. П., Абидрабо, П., Миано, Д. У., Аликаи, Т., Киньюа, З. М., Кларк, Дж. И др. (2013). Высокопроизводительные анализы RT-PCR в реальном времени для специфического обнаружения вирусов, вызывающих болезнь коричневой полосы маниоки, и их применения для тестирования посадочного материала. Патология растений, 62 , 233–242.

CAS Статья Google ученый

Аликаи Т., Омонго К.А., Марути М.Н. и др. (2007). Повторное появление болезни, вызванной вирусом коричневой полосы маниоки, в Уганде. Болезни растений, 91 (1), 24–29.

CAS Статья Google ученый

Aloyce, R.C., Tairo, F., Sseruwagi, P., Rey, M.E.C., & Ndunguru, J.(2013). Дуплексная и мультиплексная ПЦР в одной пробирке для одновременного обнаружения четырех видов бегомовируса мозаики маниока в растениях маниоки. Журнал вирусологических методов, 189 , 148–156.

CAS Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
ФАО (2010 г.). Заявленное качество посадочного материала. Протоколы и стандарты на вегетативно размножаемые культуры. ISBN.978-92-5-106425-2. Стр126.

FAOSTAT (2017).База данных ФАО. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций, Рим, Италия. http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC. По состоянию на 1 июля 2017 г.

Frison, E. (1994). Методы очистки маниока. Тропическая наука, 34 , 146–153.

Google ученый

IITA (2014). Учебное пособие по быстрому размножению стеблей маниоки. Производится участниками цепочки добавленной стоимости маниоки IYA. Доступно по адресу: http: // www. iita.org/c/document_library/get_file?p_l_id=45268&folderId=7093585&name=DLFE-8979.pdf. По состоянию на 18 сентября 2016 г.

Джарвис А., Рамирес-Виллегас Дж., Кампо Б. В. Х. и Наварро-Расинес К. (2012). Является ли маниока ответом на адаптацию к изменению климата в Африке? Биология тропических растений, 5 (1), 9–29.

Артикул Google ученый

Иеремия, С. К., Ндиетабула, И. Л., Мкамило, Г. С., Хаджи, С., Муханна, М., Чува, К., Каселе, С., Боумистер, Х., Иджумба, Дж. Н., и Легг, Дж. П. (2015). Динамика и влияние окружающей среды на взаимодействие между вирусом коричневой полосы маниоки и белокрылкой, Bemisia tabaci . Фитопатология, 105 , 646–655.

CAS Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
Kaweesi, T., Kawuki, R., Kyaligonza, V., Baguma, Y., Tusiime, G., & Ferguson, M.Е. (2014). Полевая оценка выбранных генотипов маниоки для болезни, вызванной коричневой полосой маниоки, на основе выраженности симптомов и вирусной нагрузки. Virology Journal, 11 (1). https://doi.org/10.1186/s12985-014-0216-x.

Лебот В. (2009). Тропические корнеплоды и клубнеплоды: маниока, сладкий картофель, ямс и ароиды . Наука о растениеводстве в садоводстве (17), CAB-книги. Уоллингфорд: КАБИ.

Легг, Дж. П., Иеремия, С. К., Обьеро, Х. М. и др.(2011). Сравнение региональной эпидемиологии эпидемий мозаики кассавы и вируса коричневой полосы маниоки в Африке. Virus Research, 159 (2), 161–171.

CAS Статья PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
Легг, JP, Сомадо, Э.А., Баркер, И., Бич, Л., Себальос, Х., Куэльяр, В., Элхури, В., Герлинг, Д., Хелсен, Дж., Херши, К. ., Джарвис, А., Кулаков, П., Кумар, Л., Лоренцен, Дж., Линам, Дж., МакМахон, М., Марути, Г., Миано, Д., Мтунда, К., Нтавурухунга, П., Окогбенин, Э., Пезо, П., Терри, Э., Тиле, Г., Трэш, М., Уодсворт, Дж., Уолш, С. , Винтер, С., Томе, Дж., И Фоке, К. (2014). Глобальный альянс, объявляющий войну вирусам маниоки в Африке. Food Security, 6 , 231–248.
Артикул Google ученый

Легг, Дж. П., Лава Кумар, П., Макешкумар, Т., Фергюсон, М., Канджу, Э., Нтавурухунга, П., Трипати, Л., и Куэльяр, В.(2015). Болезни, вызванные вирусом маниока: биология, эпидемиология и лечение. Достижения в вирусных исследованиях, 91 , 85–142.

Артикул PubMed Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
Марути, М. Н., Хиллокс, Р. Дж., Мтунда, К., Рая, М. Д., Муханна, М., Киозиа, Х., Рекха, А. Р., Колвин, Дж., И Треш, Дж. М. (2005). Передача вируса коричневой полосы маниоки через Bemisia tabaci (Gennadius). Журнал фитопатологии, 153 , 307–312.
Артикул Google ученый

Мбанзибва Д. Р., Тиан Ю., Тугуме А. К., Мукаса С. Б., Тайро Ф. и др. (2009). Генетически отличные штаммы вируса коричневой полосы маниоки в бассейне озера Виктория и прибрежной зоне Индийского океана в Восточной Африке. Архив вирусологии, 154 , 353–359.

CAS Статья PubMed Google ученый

Мохамед Р.А. (2002). Роль открытого карантина в региональном обмене гермоплазмой. В J. P. Legg & R.J. Hillocks (Eds.), Болезнь, вызванная вирусом коричневой полосы кассавы: прошлое, настоящее и будущее. Материалы международного семинара, Момбаса, Кения, 27–30 октября г. (стр. 28–36). Natural Resources International Limited: Эйлсфорд.

Google ученый

Мохаммед И. У., Абарши М. М., Мули Б., Хиллокс Р. Дж. И Марути М. Н. (2012).Симптомы и генетическое разнообразие вирусов с коричневой полосой маниоки, поражающих маниоку в Восточной Африке. Успехи вирусологии . https://doi.org/10.1155/2012/795697.

Нассар Н.М. и Ортис Р. (2007). Улучшение маниока: проблемы и последствия. Журнал сельскохозяйственных наук, 145 , 163–171.

Артикул Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
Нтавурухунга, П. и Легг, Дж. (2007).Новое распространение болезни, вызванной вирусом коричневой полосы кассавы, и ее последствия для перемещения зародышевой плазмы маниоки в Регионе Восточной и Центральной Африки. Источник: доступно по адресу: http://c3project.iita.org/Doc/A25-CBSDbriefMay6.pdf. По состоянию на 18 сентября 2016 г.

Ntawuruhunga, P., Dixon, AGO, Kanju, E., Ssemakula, G., Okechukwu, R., Whyte, JBA, Obiero, H., Bigirimana, S., Gashaka, G ., Лукомбо, С., Мкамило, Г., Ндиетабура, И., Тата Ханги, В., Отим Окелло, Ф., и Скофилд, Дж.(2013). Успешные инновации и уроки, извлеченные IITA в области улучшения и внедрения маниоки в регионе Восточной Африки. Африканский журнал корневых и клубневых культур, 10 (1), 41–54.

Google ученый

org/ScholarlyArticle»>
Огвок, Э., Аликай, Т., Рей, М., Бейен, Г., и Тейлор, Н. (2015). Распространение и накопление вирусов коричневой полосы маниоки в инфицированных растениях маниоки ( Manihot esculenta Crantz). Патология растений, 64 (5), 1235–1246.
Артикул Google ученый

Сисей, Дж. В., Айе, О. К., Норман, П. Э. и Ачимпонг, Э. (2016). Нодальная культура побегов и вирусная индексация выбранных местных и улучшенных генотипов маниоки ( Manihot esculenta ) из Сьерра-Леоне. Международный журнал биотехнологии и исследований молекулярной биологии, 7 (2), 20–28.

CAS Статья Google ученый

Томлинсон, Дж.A., Ostoja-Starzewska, S., Adams, I. P., Miano, D. W., Abidrabo, P., et al. (2013). Петлевая изотермическая амплификация для быстрого обнаружения возбудителей болезни коричневой полосы маниоки. Журнал вирусологических методов, 191 , 148–154.

CAS Статья PubMed Google ученый

Страхование и бесплодие: финансирование вашей фертильности

Как мы будем платить за это?

«Когда мне поставили диагноз эндометриоз, нам сказали, что единственный способ биологически создать семью — это экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО).У нас с мужем отличная работа, но наша страховка не покрывает ЭКО. Когда мы узнали, что один раунд ЭКО будет стоить 10 000 долларов, мы чуть не упали в обморок! И это без учета лекарств, которые могут стоить еще 5000 долларов. Как мы будем за это платить? »

Мы представляем серию из четырех частей, посвященную медицинскому, эмоциональному и финансовому бремени бесплодия. После исследования и опроса пар, страдающих бесплодием, я собрал практические советы о том, как ориентироваться в этом путешествии.

На этой неделе мы говорим об одном из самых серьезных препятствий на пути к лечению: стоимости. Оказывается, если вы или ваш супруг не работаете в компании, занимающейся вопросами бесплодия, вы, вероятно, захотите заплатить много денег из своего кармана. В этой статье мы сосредоточимся на том, как максимально использовать вашу страховку и где сократить расходы на этом пути.

Советы по увеличению вашей страховки:

Знайте политику своего штата в отношении ЭКО

В США 15 штатов предписывают или требуют от страховых компаний предлагать покрытие ЭКО.Вот краткое описание Американского общества репродуктивной медицины:

Эй, я могу просто перейти в одно из этих состояний, верно? Что ж, к сожалению, эта стратегия не всегда работает. В то время как страховые компании могут быть обязаны предлагать покрытие ЭКО, работодатель может выбрать, включать ли это покрытие в пакет медицинских льгот сотрудников.

Если вы работаете в крупной компании с щедрыми льготами, есть надежда! Каждый пятый работодатель выберет страхование фертильности.Если вы используете индивидуальный план от нас или другого рынка (включая Healthcare.gov), вы не найдете никакого покрытия для ЭКО даже в перечисленных выше штатах.

Если вы обнаружите, что ваша компания покрывает ЭКО, в большинстве случаев покрытие распространяется только на вас, если вы пытались зачать ребенка в течение 5 лет или у вас диагностировано заболевание (например, эндометриоз). Возможно, вам повезет и вы сможете пройти квалификацию! Узнайте больше о страховом мандате здесь.

Узнайте точно* , что будет покрывать ваша страховка*

Ух.Страшный звонок в вашу страховую компанию. Я знаю, я тоже это ненавижу! Но я бы предпочел потратить время на то, чтобы позвонить, узнать, что покрывается, чем расплачиваться за долг, потому что меня удивил счет.

До того, как я пошел к специалисту по репродуктивной медицине, я понятия не имел, какие вопросы задавать, не говоря уже о том, что спросить у моей страховой компании о том, что покрывается или не покрывается. Национальная ассоциация бесплодия составила отличный список вопросов, которые стоит задать вашей страховой компании.Такие вопросы, как: «Есть ли определенные тесты, которые необходимо пройти, прежде чем вас направят в отделение бесплодия или к специалисту в вашем плане?» или «Покрываются ли лекарства?»

Вопросы по страховке от бесплодия

Загрузите и распечатайте их. Настоятельно рекомендуем ответить на эти вопросы перед тем, как обратиться к специалисту. Вы сможете лучше общаться, что поможет вам сэкономить деньги и понять ваши варианты.

При выставлении счетов за страховку ориентируйтесь на «диагностику»

Если план вашей компании не распространяется на ЭКО, вам, вероятно, интересно, что вы можете сделать. Что ж, есть стратегия, которую вы можете использовать, чтобы хоть что-то получить из своего страхового плана (даже индивидуальных планов).

Все планы должны включать диагностическое тестирование. Страховая компания моей подруги Тессы не заплатила бы ни копейки за ЭКО, но покрывает все диагностические процедуры 80/20. Это означает, что когда врач назначил исследования и процедуры, чтобы выяснить, что вызывает ее бесплодие, страховка покрывала 80%, а ей нужно было заплатить только 20%.Она объяснила своему врачу, какие процедуры являются «диагностическими», а затем убедилась, что они правильно закодированы, чтобы получить ее страховые выплаты. Это важный разговор с вашим врачом, поскольку они обладают некоторой гибкостью в том, как они кодируют, и они вряд ли думают об этом так, как вы. Убедитесь, что ваш врач правильно кодирует диагностические процедуры, чтобы ваша страховка покрыла их. Если вы являетесь участником Take Command Health, мы с удовольствием рассмотрим ваши счета и поможем вам в этом.

Другие советы по экономии:

Скидки на лекарства

Мой друг Джесси работал в компании, которая занималась ЭКО.Она думала, что находится в хорошей форме, но затем столкнулась с другой распространенной проблемой: хотя страховка ее компании покрывала лечение бесплодия, она не покрывала лекарства, необходимые для этих процедур. Ее лекарства на один курс ЭКО стоили 5000 долларов. Ой!

К счастью, медсестра Джесси помогла ей найти скидки на лекарства в таких аптеках, как Freedom Fertility Pharmacy и Walgreens Specialty Pharmacy. Она пишет: «Через аптеку Freedom Fertility мы получили по почте лекарства на дом за небольшую часть их стоимости.«

Имейте в виду, что большинство кабинетов врачей не учитывают стоимость лекарств при оценке процедуры. Спросите медсестру, что она рекомендует или что она слышала от других пациентов: скорее всего, вы сможете сэкономить много денег на лекарствах, поспрашивая у окружающих. Если вы являетесь пользователем Take Command Health, вы можете написать нам по электронной почте, и мы поможем вам найти скидки в вашем районе и даже сможем подключить вас к дисконтной карте аптеки.

Гранты и финансовая помощь

Нет страхового покрытия? Стоимость лечения может показаться непомерно высокой.Организации существуют с единственной целью — помочь вам оплатить фертильность. Resolve собрала потрясающие ресурсы для пар, нуждающихся в финансовой помощи в рамках АРТ. Гранты и финансовая помощь доступны, если вы подадите заявку. Стоит посмотреть, подходите ли вы!

Следующие шаги

Есть другие советы, которыми вы хотели бы поделиться? Разместите их в поле для комментариев ниже.

Take Command Health хочет быть защитником вашего медицинского страхования. Хотя ваша страховая компания может не покрывать ЭКО, это не повод сдаваться! Мы хотели бы быть вашим сторонником, чтобы помочь вам, и есть шаги, которые вы можете предпринять, чтобы сэкономить деньги и разумно финансировать лечение бесплодия.

О Take Command Health

Take Command Health была запущена три года назад с целью повышения осведомленности, защиты и прозрачности запутанного мира медицинского страхования для малого бизнеса и частных лиц. Take Command Health находится в авангарде этой проблемы, являясь признанным лидером в области администрирования QSEHRA и налоговой стратегии малого бизнеса, с клиентами во всех штатах. Он работает в Аризоне, Калифорнии, Флориде, Джорджии, Индиане, Мичигане, Северной Каролине, Пенсильвании, Техасе, Теннесси и Висконсине для индивидуального страхования и предлагает HRA для малого бизнеса по всей стране.

Какие параметры влияют на скорость распространения диастолического кровотока в левом желудочке? исследования in vitro с использованием цветной допплеровской эхокардиографии в m-режиме | Ультразвук сердечно-сосудистой системы

Модель

Мы использовали индивидуализированную коммерчески доступную модель LV (Superdup’r SD1002, Vivitro Systems Inc., Виктория, Британская Колумбия, Канада), которая была модифицирована для облегчения ультразвукового опроса путем размещения портов эхопреобразователя сбоку. верхушки ЛЖ и левого предсердия. Диафрагма LV, изготовленная из силиконовой резины, имела форму полуэллипсоида (размер по длинной оси = 53 мм, диаметр основания = 44 мм, толщина = 0,9 мм).6 мм). Нормальный исходный объем ЛЖ содержал 150 мл физиологического раствора. Гидравлическая камера, окружающая диафрагму РН, была заполнена дистиллированной водой. Диафрагма LV сжималась и расширялась поршневым насосом с компьютерным программированием, который контролировал объем гидравлической жидкости. Биопротезные двухстворчатые клапаны перикарда (диаметр = 21 мм) были установлены на участках аортального и митрального клапанов. Во время экспериментов контролировали давление в аорте, ЛЖ и левом предсердии, а также скорость аортального или митрального кровотока.

Программирование формы волны

Формы волны аорты и митрального клапана были запрограммированы для имитации различных физиологических состояний.Мы запрограммировали два разных типа трансмитральных сигналов: Тип 1 (с постоянным низкоскоростным потоком диастаза) и Тип 2 (отсутствие митрального потока во время периода диастаза; не показано на рисунке 1) (рисунок 1). Хотя ЧСС варьировалась, формы трансмитральных волн были запрограммированы таким образом, чтобы сохранять форму волны E (ранняя диастолическая) и A (поздняя диастолическая или предсердная), время ускорения и время замедления постоянными на участке митрального клапана. Продолжительность аортального кровотока была установлена на уровне 35% от продолжительности цикла при ЧСС = 40 и 50 / мин, 27% при 60 / мин, 31% при 70 / мин и 36% при 80 / мин.

Рис. 1
Диаграмма скорости трансмиттерного потока 1-го типа: постоянный диастазовый поток. ЧСС = 60 / мин.
измерений CMD
измерений CMD были выполнены с использованием ультразвукового аппарата Vivid (General Electric Vingmed Ultrasound, Хортен, Норвегия). Датчик (2,5 МГц) располагался на уровне верхушки ЛЖ. Расстояние между датчиком и митральным клапаном составляло 7,6 см. Скорость красно-синего интерфейса CMD (наложение) была установлена на 92 см / сек, чтобы избежать «утечки» сигнала.Скорость развертки КМД составляла 200 мм / сек. Настройки эхокардиографического аппарата оставались неизменными во время всех экспериментов. Все изображения CMD были записаны на оптический диск или CD-ROM, а автономный анализ проводился с использованием коммерческого программного обеспечения (EchoPac для Vivid 7). Vp измеряли как наклон первой скорости наложения спектров от митрального кольца до 4 см дистальнее в левом желудочке в раннюю диастолу. Измерения Vp выполнялись 10 раз для каждого режима потока.
Гемодинамические переменные
Были изучены следующие диапазоны гемодинамических переменных: 1) ударный объем (УО): 50, 60, 70, 80 и 90 мл; 2) частота сердечных сокращений (ЧСС): 40, 50, 60, 70 и 80 ударов в минуту; 3) исходный объем ЛЖ (LVV): 130, 150, 180, 200 и 200 мл; 4) соответствие НН: пять условий; и 5) формы волны трансмитрального потока (TMF) (Тип 1: с постоянным низким потоком диастаза между ранними и поздними диастолическими волнами и Тип 2: без диастазного потока).LVV изменяли путем добавления дистиллированной воды или откачивания гидравлической жидкости из гидравлической камеры. Добавление 0, 10, 20, 30 или 40 мл воздуха в гидравлическую камеру и всасывание того же объема гидравлической жидкости из гидравлической камеры изменили податливость LV — в частности, чем больше объем воздуха, тем больше податливость LV. Исходные условия были следующими: форма волны типа 1, SV = 70 мл, ЧСС = 60 / мин, LVV = 150 мл, соответствие LV с 0 мл воздуха в гидравлической камере. Податливость ЛЖ рассчитывалась как изменение объема, деленное на изменение давления в течение периода от точки пересечения давления ЛЖ и левого предсердия до минимального давления ЛЖ в ранней диастоле.Податливость LV (мл / мм рт.ст.) в 5 экспериментальных условиях рассчитывалась следующим образом: 0 мл воздуха, 8,32 × 10 ^-3; 10 мл воздуха, 9,75 × 10 ^-3; 20 мл воздуха, 16,34 × 10 ^-3; 30 мл воздуха, 17.05 × 10 ^-3; и 40 мл воздуха, 19,92 × 10 ^-3.
Вариабельность измерений
Измерения
Vp были выполнены с использованием имеющегося в продаже программного обеспечения. Vp измеряли в двух разных случаях на 26 изображениях, сохраненных на диске одним ридером, чтобы оценить вариабельность измерений внутри ридера.Второй наблюдатель, не осведомленный об измерениях, сделанных первым читателем, также измерил Vp на этих 26 изображениях, чтобы рассчитать вариабельность между читателями.
Статистический анализ
Связь гемодинамических параметров с Vp была проанализирована с использованием парного теста Стьюдента t и одномерного регрессионного анализа. Все рассчитанные значения P были двусторонними, и значение P <0,05 считалось показателем статистической значимости.
In vitro открытие нанотел для интегральных мембранных белковых мишеней
Приготовление Nb-шаблона
Все праймеры были получены от IDT (Сан-Диего, Калифорния). E. coli -оптимизированный кодон, N-концевой FLAG-тегированный Nb-GFP ¹² (таблица I) (Genscript, NJ) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы платины Taq (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и праймеров Nb-GFP_Disp_Fw и Nb-GFP_Disp_Rv (Таблица II). HuSdL (Creative Biolabs, CD Inc., Нью-Йорк) был приобретен и амплифицирован с использованием HuSdL_Disp_Fw и HuSdL_Disp_Rv (таблица II) с последующими двумя раундами ПЦР с расширением перекрытия с праймерами HuSdL_Disp_Fw1 и HuSdL_Disp_Rv, затем сначала HuSdL_Disp_Rv_Disp_Rv, затем IISp_Disp_Rv, затем Nb-Disp_Rv. для добавления 5′-фланкирующих последовательностей, необходимых для транскрипции и трансляции in vitro .Свежеамплифицированный и очищенный на колонке продукт ПЦР клонировали в клеток E. coli Top 10 с использованием клонирования pCR2.1-TA® (Life Technologies) для анализа разнообразия последовательностей и обеспечения добавления 5′-удлинительных последовательностей. Чтобы синтезировать мутагенную библиотеку на основе матрицы Nb-GFP, была выполнена подверженная ошибкам ПЦР, как ранее опубликовано ¹³, с использованием 5′-трифосфатов 6- (2-дезокси-bD-рибофуранозил) -3,4-дигидро -8H-пиримидо [4,5-C] [1,2] оксазин-7-он (dP) и 8-оксо-2’дезоксигуаносин (8-оксо-dG).По 0,4 мМ каждого из dATP, dCTP, 2′-dPTP (Trilink Biotechnologies, Сан-Диего, США) вместо dTTP и dGTP и 0,8 мМ 8-оксо-2′-dGTP (Trilink Biotechnologies, Сан-Диего, США) использовали в общая смесь dNTP, которая использовалась для амплификации Nb-GFP с помощью Nb-Lib_Disp_Fw и Nb-GFP_Disp_Rv (таблица II). Второй раунд амплификации был проведен с обычными dNTP, чтобы гарантировать отсутствие мутагенных нуклеотидов, которые могут повлиять на последующие последующие процедуры.
Таблица 1 Первичные последовательности Nb-GFP и Nb-GLUT-1 Таблица 2 Список праймеров, используемых для отображения мРНК / кДНК Nb-GFP, мутантной библиотеки Nb-GFP и HuSdL
Получение мРНК
Матрица / библиотека Nb составляли in vitro, транскрибировали и обрабатывали Turbo DNase с использованием набора для транскрипции Megascript® T7 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.мРНК очищали с использованием набора для очистки транскрипции мРНК Megaclear (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. 250 нг продукта ПЦР матрица Nb / библиотека обычно давали до 100 мкл очищенной мРНК в концентрации 1-2 мкг / мкл. Высокоочищенную мРНК анализировали на целостность и размер на 0,8% TBE-агарозном геле с помощью электрофореза против ступенчатой РНК Century (Life Technologies).
Лигирование мРНК-пуромицин-линкер
Очищенную мРНК лигировали с пуромициновым линкером, Nb_Disp_Puro, с использованием ДНК-шины, Nb-GFP_Disp_Splint или HuSdL_Disp_Splint (Таблица II). Для каждых 60 мкл реакции 5 мкг мРНК сначала отжигали с 2,67 мкМ сплинтом и 2,67 мкМ пуромициновым линкером в присутствии буфера 1 × T4 ssRNA для лигазы. После отжига добавляли 1 мМ АТФ, 1 мкл ингибитора мышиной РНКазы (New England Biolabs, NEB), 3 мкл оцРНК-лигазы Т4 и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Нелигированный линкер и сплинт расщепляли с использованием 5 мкл лямбда-экзонуклеазы (NEB) в общем объеме 240 мкл, содержащего 24 мкл буфера для лямбда-экзонуклеазы, и последующей инкубации при 37 ° C в течение 45 минут.После добавления 60 мкл 1 М трис-HCl, pH 7,5, фермент инактивировали инкубацией при 65 ° C в течение 5 минут и реакционную смесь помещали на лед. Продукт лигирования мРНК-пуромициновый линкер очищали с использованием 70 мкл магнитных шариков OligodT ₂₅ (NEB) в соответствии с инструкциями производителя и дважды элюировали 30 мкл (15 мкл × 2) 10 мМ трис-HCl, pH 7,5. Эффективность лигирования этого метода обычно составляла ~ 40–60%.
Образование слияния мРНК-Nb
Продукт лигирования осаждали с помощью соосаждения розового цвета (биолин) и ресуспендировали в 6.5 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 7,5. In vitro трансляцию выполняли с использованием растворов A и B набора PURExpress® (NEB). Ресуспендированный продукт лигирования смешивали с 1 мкл ингибитора мышиной РНКазы (NEB), 10 мкл раствора A и 7,5 мкл раствора B. Реакционную смесь инкубировали при 37 ° C в течение 1,5 часов с последующей инкубацией на льду в течение 10 минут. К реакционной смеси добавляли 2,5 мкл 1 M MgCl ₂ и 12,5 мкл 2 M KCl с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 10 минут. Реакционную смесь инкубировали при -20 ° C в течение ночи, чтобы обеспечить образование стабильного слияния.После этого слияния повторно очищали с использованием магнитных шариков OligodT ₂₅ (NEB) в соответствии с инструкциями производителя и элюировали 30 мкл 10 мМ трис-HCl, pH 7,5. Образование слияния анализировали вестерн-блоттингом с использованием первичного антитела против FLAG-M2 (Sigma) для обнаружения сконструированной N-концевой FLAG-метки на всех Nbs. Несвязанные фракции после очистки oligodT ₂₅ использовали в качестве неотображаемых контролей Nb (фиг. 3d и фиг. 5).
Рисунок 2
Схема отображения мРНК / кДНК Nbs.
(a) Nb-кодирующая ДНК in vitro, транскрибируется в (b) мРНК и (c) лигирована с 3′-пуромицином (P), содержащим линкер ДНК. (d) После трансляции in vitro и образования слияния , (e) выполняется обратная транскрипция для синтеза кДНК. (f) комплексы мРНК-кДНК-Nb подвергаются действию интересующего антигена (Ag), который иммоболизируется на твердофазной аффинной матрице. После промывок и элюирования проводят ПЦР для извлечения полноразмерных Nb-кодирующих ампликонов (N / C — N- и C-концы отображаемого Nb).
Рисунок 3 Отображение
мРНК / кДНК Nb-GFP.
(a) ДНК, кодирующая Nb-GFP ¹² была in vitro, транскрибировалась с (b) мРНК и (c) лигировалась с 3′-пуромицином (P), содержащим линкер ДНК. Сдвиг молекулярной массы отслеживали на агарозном геле. (d) In vitro трансляция привела к отображаемым ковалентным слияниям мРНК-Nb-GFP (F), обнаруженным на вестерн-блоттинге по увеличению молекулярной массы до ~ 170 кДа, об / с, не отображаемый Nb-GFP (~ 15 кД). (e) слияния (+ ve) или нетранслируемые лигирования (-ve) подвергали обратной транскрипции и (f) осуществляли селекцию связывания на очищенном белке GFP с иммобилизованным Ni-NTA.Связующие Nbs были элюированы, и последовательности были регенерированы с помощью ПЦР. Отсутствие продукта ПЦР из -ve контроля свидетельствует об успешном антигенном отборе. (М — маркеры молекулярной массы).
Рисунок 4
Специфичность антигенной селекции во время отображения мРНК / кДНК.
Мутантная библиотека, созданная на основе шаблона Nb-GFP, отображалась с использованием метода отображения мРНК / кДНК, описанного в этой рукописи, и подвергалась воздействию либо GFP, либо P-гликопротеина мыши (mP-gp), который является интегральным мембранным транспортером. белок очищен, как ранее опубликовано ¹⁸.После промывок и элюирования связующие последовательности регенерировали с помощью ПЦР. Гель агарозы показывает, что для одного и того же исходного материала (библиотека и реакция RT) были получены Nb-специфические связывающие вещества для отбора с GFP в качестве антигена, 40% последовательностей которых было подтверждено как Wt Nb-GFP, тогда как Nb-специфическая ПЦР продукт отсутствовал после воздействия mP-gp в качестве антигена, подтверждая, что метод отображения мРНК / кДНК был успешным в удалении неспецифического связывающего Nbs.
Фиг. 5 Отображение
мРНК / кДНК в человеческой однодоменной библиотеке (HuSdL).
HuSdL отображался, как описано в разделе «Материалы и методы». OligodT ₂₅-очищенный и ковалентно связанный продукт слияния мРНК-Nb был обнаружен по значительному увеличению молекулярной массы (~ 170 кДа) на вестерн-блоте с использованием первичного антитела M2 против FLAG-мыши (Sigma). Непроявленные Nbs (~ 15 кДа) наблюдались в несвязанной фракции на стадии очистки oligodT ₂₅. Показанные полосы относятся к одному и тому же блоту и представляют 4 независимых эксперимента.
Обратная транскрипция
Реакцию объемом 60 мкл проводили с использованием элюированного слияния, 80 нМ RT-праймера (таблица II) и остальных компонентов набора для синтеза первой цепи с надстрочным индексом III (Life Technologies), в соответствии с инструкциями производителя. Фермент инактивировали при 70 ° C в течение 15 мин.
Связывание и отбор антиген-Nb
1-3 мкг His-меченного рекомбинантного GFP Pierce (ThermoFisher) или очищенного GLUT-1 связывали с 50 мкл магнитных гранул агарозы Ni-NTA (Qiagen), предварительно уравновешенных в буфере связывания (20 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 300 мМ NaCl, 0,05% Твин 20) при 4 ° C в течение 2 часов. К этой реакции добавляли 2 мкг BSA (Amresco) и дополнительно инкубировали при 4 ° C в течение 1 часа. После промывки каждой из 5 объемов колонки буфера связывания и промывки / взаимодействия (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, 20 мМ имидазол, pH 8,0) шарики ресуспендировали в Wash / Interact. с 2 мкг BSA. Реакцию обратной транскрипции добавляли к шарикам и инкубировали на ротаторе для пробирок при комнатной температуре в течение 1 часа. Гранулы промывали 5 раз в общей сложности 25 объемами колонки (5 × 5) промывкой / взаимодействием, дважды — всего 10 объемами колонки (5 × 2) трис-промывочным буфером (20 мМ трис-HCl, pH 8.0, 0,05% Твин 20, 20 мМ имидазол, pH 8,0) и элюировали 30 мкл буфера для элюции (20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Твин 20, 300 мМ имидазол, pH 8,0).
Получение и анализ последовательностей
Антиген-специфичные последовательности Nb были получены с помощью ПЦР с использованием 1 мкл элюции в реакционной установке объемом 100 мкл с ДНК-полимеразой платины taq и праймерами Nb-GFP_Disp_Fw и Nb-GFP_Disp_Rv или HupSdL_Dis (Hup_dLw_Dis (Hup_dLw_Dis) II). Свежеамплифицированный и очищенный на колонке (Qiagen) продукт ПЦР клонировали в pCR2.1-TA® (Life Technologies) и трансформировали в клеток E. coli Top 10 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Случайные колонии секвенировали с использованием амплификации по типу катящегося круга (RCA) и секвенирования по Сэнгеру (Genewiz). Последовательности in silico транслировали с помощью EXPASY-Translate и анализировали с использованием белка BLAST®. Представляющие интерес последовательности Nb амплифицировали из продукта RCA с использованием полимеразы Cloned Pfu (Agilent) и праймеров HuSdL_TOPO_Fw и HuSdL_TOPO_Rv (Таблица II).Плазмиду следов в реакции переваривали с использованием 1 мкл Dpn1 (NEB) при 37 ° C в течение 1 часа. Свежеамплифицированный и очищенный на колонке продукт ПЦР клонировали в pET100-D-TOPO® (Life Technologies) и трансформировали клеток E. coli Top 10. Плазмиды из колоний трансформантов подтверждали секвенированием на наличие последовательности Nb для правильной экспрессии в рамке считывания. После подтверждения последовательности плазмиды трансформировали в E. coli BL21 (DE3) Star (Life Technologies) для малой / крупномасштабной экспрессии и очистки Nb.
Экспрессия и очистка Nb-GLUT-1
Маломасштабные тесты экспрессии Nbs, клонированных в pET100-D-TOPO в звездчатых клетках E. coli BL21 (DE3), были выполнены в 5 мл Luria-Bertani (LB) среда, содержащая 50 мкг / мл карбенициллина (Omega Scientific). Клетки культивировали при 37 ° C со встряхиванием при 220 об / мин в течение 16 часов. Промотор lac индуцировали изопропил-β-тиогалактозидом (IPTG, Anatrace) в течение 1 часа. 500 мкл клеток собирали центрифугированием и ресуспендировали в 100 мкл воды и 100 мкл 2-кратного буфера для образцов трис-глицина SDS (Life Technologies).Образцы обрабатывали на предварительно отлитом геле 4–20% Mini PROTEAN TGX (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Экспрессию детектировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к His-зонду (Santa Cruz Biotechnology) в качестве первичного обнаружения при разведении 1: 2000 в TBST (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,005% Tween-20) и с козьим -антимышиный поли-HRP (Thermo Scientific) в качестве вторичного обнаружения при разведении 1: 10 000 в TBST. Для проявления блота использовали хемилюминесцентный субстрат SuperSignal West Dura (Thermo Scientific).Клоны с высокой экспрессией были отобраны для крупномасштабной очистки.
Для крупномасштабной очистки Nbs были сверхэкспрессированы в звездчатых клетках BL21 (DE3) в потрясающем бульоне (120 г триптона, 240 г дрожжевого экстракта и 40 мл глицерина в 10 л) в ферментере BioFlo 415. Промотор lac индуцировали IPTG (Anatrace) при OD 1,5 в течение 2 часов. Клетки собирали и разрушали с помощью разрушителя клеток (Constant Systems), содержащего 20 мМ трис-HCl pH 8,0, 100 мМ NaCl и 15% глицерин. Клетки разрушались при 20 кг / дюйм2.Клеточный дебрис удаляли центрифугированием с ротором JLA 16.25 при 16000 об / мин в течение 30 минут. Супернатант собирали и инкубировали с никелевой аффинной смолой (Ni-NTA Agarose, Qiagen) при 4 ° C в течение 1,5 часов. Смолу промывали буферами, содержащими различные концентрации имидазола (30 мМ, 60 мМ и 80 мМ) в 20 мМ HEPES pH 7,5 и 150 мМ NaCl. Белок элюировали со смолы промывочным буфером плюс 300 мМ имидазол. Затем элюат снова разбавляли в 10 раз и инкубировали с Ni-NTA агарозой в течение 1 раза.5 часов. Смолу снова промывали буферами, содержащими различные концентрации имидазола (30 мМ и 60 мМ) в 20 мМ HEPES pH 7,5 и 150 мМ NaCl. Белок элюировали со смолы промывочным буфером плюс 300 мМ имидазол. Белок концентрировали примерно до 5 мг / мл перед нанесением на колонку для эксклюзионной хроматографии (Superdex 200 10/300; GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 мМ HEPES pH 7,5 и 150 мМ NaCl). Фракции с наибольшими пиками собирали и быстро замораживали в жидком азоте для экспериментов SPR и вестерн-блоттинга.
Клонирование GLUT-1
кДНК человека получали из коллекции транспортеров (Open Biosystems, Pittsburgh, PA). Тег-флаг эпитопа (5′-ATG GAC TAC AAG GAC GAT GAC GAT AAG-3 ‘) был введен на 5′-конце, а тег TEV-10xHis (5’-GAG AAC TTG TAC TTC CAG GGT AGA GGT TCT CAC CAC CAT CAC CAC CAT CAC CAC CAT CAC-3 ‘) вставляли на 3’-конце SLC2A1 , затем субклонировали в вектор экспрессии Pichia pastoris , pPICZ-A (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), в EcoRI и Сайты SalI. 5 мкг плазмид линеаризовали с помощью PmeI (NEB, Ipswich, MA) и вводили в электро-компетентные клетки P. pastoris KM71H (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Всего 48 колоний были выбраны для мелкомасштабной экспрессии с 0,5% метанолом для тестирования экспрессии GLUT-1, который был обнаружен с помощью антител против flag (Sigma, Сент-Луис, Миссури) или антител против his (Clontech, Mountain View). , CA) вестерн-блоттингом.
Очистка GLUT-1
Полноразмерный GLUT-1 с N-концевой меткой Flag и C-концевой меткой 10X His был сверхэкспрессирован в Pichia pastoris в минимальной среде в ферментере BioFlo 415.Через 18 часов после индукции 5% метанолом клетки собирали и разрушали в 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 100 мМ NaCl и 15% глицерине с помощью разрушителя клеток (Constant Systems) при 40 kpsi. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием с ротором JLA 8.1 при 5000 об / мин в течение 20 минут и мембранную фракцию выделяли с помощью центрифугирования с ротором JLA 16. 25 при 16000 об / мин в течение 3 часов. Белок экстрагировали из мембранной фракции 0,5% (мас. / Об.) Неопентилгликоля лаурилмальтозы (LMNG, Anatrace) в 20 мМ трис-HCl, pH 8.0, 100 мМ NaCl и 15% глицерин при 4 ° C в течение 2,5 часов. Фракцию, растворимую в детергенте, собирали и инкубировали с никелевой аффинной смолой (Ni-NTA Superflow, Qiagen) при 4 ° C в течение 1,5 часов. Смолу промывали буферами, содержащими различные концентрации имидазола (30 мМ, 60 мМ и 80 мМ) в 20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,001% (мас. / Об.) LMNG. Белок элюировали промывочным буфером плюс 300 мМ имидазола. Элюат концентрировали примерно до 1 мг / мл перед нанесением на обессоливающую колонку (HiPrep 26/10; GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 мМ HEPES pH 6.7, 0,001% СПГ). Фракции пиков собирали и мгновенно замораживали в жидком азоте для SPR.
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)
Измерения SPR были выполнены с использованием 404pi (Bioptix). Для каждого эксперимента около 3 мкМ GLUT-1 в 20 мМ HEPES, pH 6,7, 0,001% LMNG иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа CMD-200/150 (Xantec / Bioptix), используя реакцию аминового сочетания с активацией через 231 мг / кг. мл EDC (1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид) и 33 мг / мл NHS (N-гидроксисукцинимид) и дезактивация после иммобилизации с использованием 1 М трис-HCl, pH 7.5. GLUT-1 иммобилизовали при скорости потока 20 мкл / мин до 2000 единиц ответа (RU), в то время как контрольную поверхность обрабатывали 20 мМ HEPES, pH 6,7, 0,001% LMNG с идентичными процедурами активации и дезактивации. Рабочий буфер прибора, используемый на этом этапе, представлял собой 20 мМ HEPES, pH 7,5, 20 мМ NaCl, 50 мкМ EDTA, 0,001% LMNG, 0,005% Tween 20. Затем рабочий буфер заменяли на 20 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl. , 50 мкМ ЭДТА, 0,001% LMNG, 0,005% Твин 20. Nb-GLUT-1 (или другие Nbs) вводили со скоростью потока 50 мкл / мин и в концентрациях от 1 нМ до 1 мкМ, с несколькими промежуточные пустые инъекции буфера.Регенерации выполняли с использованием 5 мкл 0,1 М NaOH. Данные анализировали на Scrubber2 (программное обеспечение BioLogic) с использованием метода двойного вычитания. Значения включения / скорости ассоциации ( k a), выключения / скорости диссоциации ( k d) и константы диссоциации (K _D) вычисляли из функции соответствия, доступной в программном обеспечении.
Вестерн-блот-детекция GLUT-1 с использованием Nb-GLUT-1
Полноразмерные GLUT-1 и Nb-GLUT-1 очищали в соответствии с указанным выше протоколом, и концентрации определяли путем сравнения со стандартами альбумина (Thermo Scientific ) на гелях, окрашенных кумасси.Очищенные образцы GLUT-1 и Nb-GLUT-1 обрабатывали на предварительно отлитых SDS-PAGE гелях Mini PROTEAN TGX с градиентом 12% или 4-20% (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Образцы на гелях переносили на мембраны из нитроцеллюлозы / ПВДФ с помощью системы Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Блокирование выполняли с использованием 5% обезжиренного молока в буфере TBST (50 мМ Трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин-20; время от времени до 0,1% Твин-20 использовали для снижения фонового шума) в течение 30 мин или ПВА (поливиниловый спирт), разведенный 1:50 в TBST в течение 2 мин.Промывки и обработки антителами проводились либо традиционно, либо с помощью системы SNAPid (EMD Millipore Corporation). Для обнаружения GLUT-1 очищенный Nb-GLUT-1 в концентрации 2 мг / мл использовали в качестве первичного антитела при разведении 1: 1000 в TBST и HRP-rProtein A (Life Technologies) в качестве вторичного антитела при разведении 1: 5000 в TBST. . Для обнаружения Nb-GLUT-1 напрямую использовали 1: 5000 HRP-rProtein A, не требуя вторичных антител. Для проявления блотов использовали SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific).
Димеризация RIO2-киназы человека in vitro
РЕФЕРАТ
RIO-белки образуют консервативное семейство атипичных протеинкиназ. RIO2 — это серин / треониновая протеинкиназа / АТФаза, участвующая в созревании рибосом до 40S. Современные кристаллические структуры белков Rio2 архей и грибов сообщают о мономерной форме белка. Здесь мы описываем три атомные структуры киназы RIO2 человека, показывая, что она образует гомодимер in vitro . После самоассоциации каждый протомер АТФ-связывающий карман частично ремоделируется и обнаруживается в состоянии апо. Гомодимеризация опосредуется ключевыми остатками, которые, как ранее было показано, ответственны за связывание АТФ и катализ. Этот необычный димер протеинкиназы in vitro обнаруживает сложный механизм, в котором идентичные остатки участвуют в связывании субстрата и формировании олигомерного состояния. Мы предполагаем, что такое олигомерное состояние может образовываться также in vivo, и может функционировать в поддержании белка в неактивном состоянии и может использоваться во время импорта.
Введение
Биогенез рибосом представляет собой сложный механизм, инициируемый в ядрышке с транскрипцией длинного предшественника рибосомной РНК (пре-рРНК) РНК-полимеразой I и заканчивающийся в цитоплазме после взаимосвязанных событий созревания, которые включают метилирование, псевдоуридилирование нуклеотидов, эндо- и экзонуклеолитическое расщепление и обязательный транзит через ядерную пору ^1,2.Некоторые из 200 ассоциированных факторов (AF), участвующих в биогенезе рибосом ^3–8 обнаруживают характерные мотивы последовательностей для ферментов, таких как Ser / Thr киназы, GTPases, RNA helases, и, вероятно, участвуют во многих контрольных точках. Три белка, образующие семейство киназ RIO, а именно Rio1, Rio2 и Rio3, играют особую роль в цитоплазматическом созревании пре-рРНК pre-40S ^9–13. Эти белки образуют семейство киназ Ser / Thr, построенных вокруг центрального домена протеинкиназы, но не демонстрируют дальнейшего сходства последовательностей с другими эукариотическими протеинкиназами (ePK), и как таковые были классифицированы как атипичные протеинкиназы ^14,15.В дрожжах RIO1 и RIO2 являются важными генами и их продукты, Rio1 и Rio2, ассоциируются с рибосомными частицами пре-40S ^11,13,16 и участвуют в расщеплении D-сайта in vivo ^{11, 13,16,17}. Rio1 дополнительно участвует в развитии клеточного цикла и стабильности рДНК ^18–20. Индивидуальное истощение Rio1 и Rio2 приводит к накоплению пре-рРНК 20S в дрожжах ^16,17,21,22 и пре-рРНК 18S-E в клетках человека ^9,23.У человека hRIO3 является исключительно цитоплазматическим и образует часть частиц пре-40S, ассоциированных с пре-рРНК 18S-E. Делеция hRIO3 приводит к накоплению 21S рРНК у человека ¹⁰.
Присутствие человеческого белка RIO2 (далее hRIO2), но не его активность, необходимо для рециркуляции фактора hENP1 из цитоплазмы в ядро. Напротив, активность hRIO2 требуется для высвобождения hDIM2, hLTV1, hNOB1 и hRRP12 из пре-рРНК 18S-E ^13,24.Кроме того, hRIO2 фосфорилирует hDIM1 и автофосфорилирует hRIO2 in vitro ^13,25. В дрожжах каталитическая активность Rio2 требуется не для его ассоциации с частицами до 40S, а, скорее, для его высвобождения ^26,27. В целом эти наблюдения привели к предположению, что Rio2 является скорее АТФазой, чем протеинкиназой. Наконец, положение Rio2 на частице пре-40S было установлено в P-сайте, близком к домену IV Tsr1, где оба белка блокируют A- и P-сайты на субъединице 40S ^28,29.
Структура архей Archeoglobus fulgidus Rio2 (afRio2) и Chaetomium thermophilum Rio2 (ctRio2) была решена в апо и АТФ-связанных состояниях ^14,26,30. Эти атомные модели раскрывают доменную организацию белков Rio2 и дают представление о механизме ферментативной реакции. Однако каждая из этих структур описывает Rio2 как мономер. Здесь мы сообщаем, что hRIO2 может образовывать гомодимер в растворе. Мы решили кристаллическую структуру гомодимера hRIO2 и наблюдали, что несколько инвариантных или высококонсервативных остатков вовлечены в интерфейс димера.В гомодимере hRIO2 сайт связывания АТФ модифицирован в конформацию, предотвращающую связывание АТФ. Более того, остатки, участвующие во взаимодействии гомодимеров, также необходимы для связывания АТФ и катализа. Исходя из структуры, ферментативная активность и образование димеров будут взаимоисключающими, а димеризация несовместима с ассоциацией частиц до 40S. В отсутствие свидетельств in vivo до сих пор, мы предполагаем, что это димерное состояние могло быть временным и могло представлять конформацию, используемую для импорта белка в ядро.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ раствора человеческого RIO2
Rio2 представляет собой филогенетически консервативный белок, размер которого варьируется от примерно 30 кДа в архее A. fulgidus до примерно 60 кДа у человека. Белки организованы вокруг N-концевого домена крылатой спирали, за которым следует классическая архитектура домена киназы с N- и C-концевыми долями. У высших эукариот С-конец содержит дополнительные элементы, такие как ядерный экспортный сигнал (NES) ^31,32.Было обнаружено, что полноразмерный белок hRIO2 плохо экспрессируется и очень нестабилен, и поэтому сначала были сконструированы различные укороченные на С-конце конструкции, чтобы удалить естественно развернутые области белка. Мы также создали конструкции, которые удаляли развернутую петлю, расположенную между остатками 131–146, поскольку эта петля способствовала нестабильности белка и сильному неспецифическому связыванию со смолой Ni ⁺ -NTA и Co ^{2 + —} NTA. Ферментативную активность усеченных образцов контролировали с помощью анализа фосфорилирования, как описано у Zemp et al.2009 ¹³, и по сравнению с полноразмерными hRIO2 и ctRio2 (Рисунок S1). Активность фосфорилирования была обнаружена для всех конструкций, демонстрируя, что усечения не нарушают ферментативную активность.
Для оценки олигомерного состояния hRIO2 в растворе мы использовали аналитическое ультрацентрифугирование скорости седиментации (SV-AUC). С этой целью мы очистили до гомогенности конструкцию hRIO2, включающую остатки 1-321, с делецией развернутой петли (остатки 131-146) ^26,30.В качестве контроля мы использовали полноразмерный ctRio2 ²⁶. Концентрации белка варьировали от 3,75 мкМ до 30 мкМ для ctRio2 и от 3,37 до 27 мкМ для hRIO2 в SV-AUC (рис. 1A – 1D). Для ctRio2 непрерывные графики распределения c (s) показали один основной вид седиментации с коэффициентом седиментации 3,16 S и расчетной молекулярной массой 44,80 кДа, что близко к теоретическому значению 47,24 кДа для мономера. Эти результаты показывают, что ctRio2 ведет себя как один мономерный вид при всех протестированных концентрациях белка (рис.1А и 1С и таблица 1). Для hRIO2 (1-321) Δ (131-146) анализ c (s) выявил поведение, зависящее от концентрации, с подавляющим большинством (> 94%) мономера при самых низких концентрациях (3,375 мкМ) и увеличивающейся доля димера при более высоких концентрациях (> 20% при 27 мкМ) (рис. 1B и 1D и таблица 1). В отличие от известных атомных моделей afRio2 и ctRio2, эти эксперименты со скоростью оседания показывают способность hRIO2 (1-321) Δ (131-146) образовывать гомодимеры.
Рис. 1: Исследования с помощью аналитического ультрацентрифугирования (AUC) и структура киназы RIO2 человека. Эксперименты с AUC
проводили при 4 ° C со скоростью 50 000 об / мин. Для наглядности показано только одно из трех измерений, соответствующих примерно 15-минутным временным интервалам. Непрерывное распределение размеров (c (s)) (ось y) нанесено как функция коэффициента седиментации (ось x) в системе Svedberg (S). Распределения коэффициентов седиментации c (s) определяли из анализа данных поглощения при 280 нм Sedfit / Sedphat ^50,52.
A) Наложение экспериментальных и подобранных профилей скорости седиментации (вверху) и их различия (внизу) для ctRio2 при 15 мкМ и B) hRIO2 (1-321) Δ (131-146) при 13,5 мкМ.
C) ctRio2 полной длины при 30 мкМ (оранжевая линия), 15 мкМ (черная линия), 7,5 мкМ (пунктирная линия) и 3,75 мкМ (пунктирная линия) появлялся при всех концентрациях в виде мономера. Данные о скорости седиментации были построены с использованием программного обеспечения GUSSI.
D) чRIO2 (1-321) Δ (131-146) образцов при 27 мкМ (оранжевая линия), 13.Анализировали 5 мкМ (черная линия), 6,75 мкМ (пунктирная линия) и 3,375 мкМ (пунктирная линия). hRIO2 (1-321) Δ (131-146) появляется в виде димера при увеличении концентрации.
E) Структура hRIO2 (1-353) Δ (131-146), включающая остатки от 1 до 353. Крылатая спираль расположена на N-конце, две доли киназ помечены и соединены петля линкера (черного цвета). Так называемая C-спираль (светло-зеленая), F-спираль (пурпурный), глициновая петля (красная), каталитическая петля (синяя) и активационная петля (желтая) также показаны и помечены в соответствии с каноническим представлением ¹⁵.С-концевые остатки F-Helix окрашены в розовый и оранжевый цвета. Этот и все последующие структурные рисунки были созданы с помощью PyMOL ⁵⁸.
Таблица 1
Аналитические исследования ультрацентрифугированием hRIO2 (1-321) Δ (131-146) и полноразмерного ctRio2.
Определение структуры
Чтобы охарактеризовать это неожиданное димерное состояние hRIO2, мы решили использовать кристаллизацию белка, поскольку она обычно выполняется при высоких концентрациях, благоприятных для димеризации hRIO2.Для конструкции, содержащей остатки 1-321, были собраны наборы данных нативной дифракции с разрешением до 3,2 Å, хотя и с проблемами воспроизводимости кристаллизации, ограниченной дифракцией и невозможностью определить структуру путем молекулярного замещения. Напротив, конструкция с удаленной петлей (остатки с 131 по 146) предоставила кристаллы природного и производного Se-Met белка, для которых были собраны данные дифракции (таблица 2). Структуру hRIO2 (1-321) Δ (131-146) определяли фазированием SAD на кристаллы белка, производного от Se.Уточненную структуру использовали в качестве модели для последующего решения кристаллической структуры hRIO2 (1-321) и более длинной конструкции hRIO2 (1-353) Δ (131-146). Все статистические данные уточнения для трех атомных структур можно найти в таблице 2.
Таблица 2
Кристаллографические данные и статистика уточнения.
Общее описание структуры
Киназа hRIO2 принимает такую же складку, как afRio2 (1TQP) из археи A. fulgidus и ctRio2 (4GYI) из термофильных грибов ^26,30.N-конец (остатки от 10 до 75) складывается как домен крылатой спирали (рис. 1E), который расположен рядом с двумя долями домена киназы Рио (соответственно остатки 76–190 и 196–291). Структура hRIO2 содержит типичные мотивы канонических протеинкиназ Ser / Thr с C-спиралью (светло-зеленый), F-спиралью (пурпурный), каталитической петлей (темно-синим) и глициновой петлей (красной, также известной как П-петля). Шарнирный линкер (остатки 191-195, черный), участвующий в распознавании аденинового фрагмента АТФ в afRio2, соединяет две доли киназного домена (рис.1E). На карте электронной плотности в активном центре или рядом с ним не видно электронной плотности для АТФ или любого лиганда.
hRIO2 (1-321) и hRIO2 (1-353) Δ (131-146) имеют среднеквадратичное отклонение (rmsd) 1,2 Å над углеродом 249 C- α и различаются в основном относительным положением C-доли (рис. S2A). Несмотря на идентичность последовательностей и сходство структуры с hRIO2, как ctRio2, так и afRio2 демонстрируют несколько разные ориентации доменов, что показано относительным среднеквадратичным значением. 2,5 Å (221 C- α атомов углерода) и 1.5 Å (244 C- α атомов углерода) соответственно (рис. S2B и S2C). В частности, N-концевые домены крылатой спирали и C-концевые доли киназного домена находятся в слегка измененной ориентации (Fig. S2).
Структура гомодимера RIO2 человека
В асимметричной единице мы наблюдаем гомодимер, образованный ассоциацией двух протомеров hRIO2 в ориентации голова к голове независимо от трех пространственных групп или размера конструкции, которую мы использовали (рис. 2A) . F- и C-спирали формируют основную часть интерфейса гомодимеров без значительного воздействия на N-концевые домены крылатой спирали.F-спираль одного протомера взаимодействует с F-спиралью другого протомера в антипараллельном режиме (Fig. 2B).
Рис. 2: RIO2 человека образует гомодимеры
A) RIO2 человека взаимодействует с самим собой с образованием взаимосвязанного гомодимера с ориентацией голова к голове. Общий вид гомодимера hRIO2 показан в той же ориентации, что и на фиг. 1А, с протомером А, сохраненным в той же ориентации.
B) Крупным планом интерфейс гомодимера вокруг F-Helix. Один протомер показан серой поверхностью. Солевые мостики между остатками D271 и K267 и остатками K267 и D271 поддерживают тесное взаимодействие двух F-спиралей. R264 каждого протомера складывается вместе посредством ван-дер-ваальсовых взаимодействий, тогда как Y261 участвует в сети водородных связей с K106 и D228 другого протомера.
C) Увеличенное изображение интерфейса гомодимера вокруг области связывания АТФ. Один протомер показан серой поверхностью. Каталитический остаток D228 участвует в Н-связывании с Y261 и K106, тогда как основная цепь K105 взаимодействует с h355, а Q249 стабилизирует боковую цепь K105.E231 взаимодействует с W260. Показаны каталитические остатки K123 и D246.
D) Крупным планом интерфейс гомодимера вокруг C-Helix. C-конец α -спираль окрашена в розовый и оранжевый цвета. Алифатические остатки, такие как L153 и L156, обеспечивают силу взаимодействия Ван-дер-Ваальса, которая дополняет многие другие взаимодействия между двумя протомерами.
Области связывания АТФ через глициновую петлю (остатки K105 и E106), активационную петлю (D246 и Q249) и каталитическую петлю (D228 и E231) обеспечивают значительную часть взаимодействующей поверхности (рис.2С). Многочисленные полярные взаимодействия обнаружены между D228 одного протомера и гидроксильными группами Y261 и R264 другого протомера (рис. 2С). Каждая C-спираль протомера (светло-зеленый) обращена к C-спирали противоположного протомера в антипараллельном режиме (Fig. 2D), и это взаимодействие в основном ограничивается контактами Ван-дер-Ваальса, обеспечиваемыми L153 и L156. В целом, полная поверхность взаимодействия включает 1,570 Å ² на протомер.
В самой длинной кристаллизованной форме hRIO2 (остатки от 1 до 353) некоторые дополнительные С-концевые остатки образуют спиральную упаковку α− на границе раздела между двумя протомерами, чтобы еще больше расширить сложную поверхность взаимодействия (остаток E299 и R129 ; Инжир.2А и 2D). Важно отметить, что все решенные структуры hRIO2 показывают димерную организацию в асимметричной единице. Взятые вместе с результатами экспериментов по седиментации, наблюдаемая димеризация hRIO2 может имитировать биологическую ситуацию.
α I ctRio2 принимает другую конформацию в hRIO2
Помимо олигомерного состояния, существенное различие между моделями hRIO2 и ctRio2 заключается в положении эукариотической специфической α -спирали ( α I, оранжевый), который упаковывается в непосредственной близости от сайта связывания АТФ в ctRio2 ²⁶ (рис.3А и 3Б). В ctRio2 С-концевые остатки (325-343) образуют длинную α -спираль ( α I), которая оборачивается вокруг белка и вносит вклад в окружение сайта связывания АТФ (рис. 3B). α I взаимодействует с долями N- и C-киназ белка и связан с остальной частью белка через короткую α -спираль (остатки 317-322, розовые), заключенную в петлю (рис. 3B). ). В hRIO2 большинство эквивалентных остатков образуют непрерывную α -спираль, которая упаковывается против С-спирали вдали от сайта связывания АТФ (рис. 3С). Из-за гомодимеризации hRIO2 α I не может принять ту же ориентацию, что наблюдается в ctRio2. В недавно полученной кристаллической структуре hRIO2, связанной с ингибитором ³³, та же область белка принимает другую вторичную структуру, образуя β -лист с остатками частично неупорядоченной петли β 6- α 5 ( Рис. 3D). Несмотря на то, что делеция петли β 6- α 5 (остатки 131-146) в нашем исследовании не изменяет общую структуру hRIO2 или ее олигомерную организацию, петля β 6- α 5 в hRIO2 (6HK6), частично занимает положение, в котором находится спиральное удлинение (данное исследование).Таким образом, наблюдаемой здесь α -спирали, вероятно, способствует делеция петли β 6- α 5 в нашей конструкции.
Рис.3: α Я могу принять две конформационные ориентации
A) Наложение hRIO2 (1-353) Δ (131-146) и ctRio2 было выполнено в Coot ⁵⁹. ctRio2 отображается серым цветом.
B) Сосредоточьтесь на α I от ctRio2. Остатки 311–324 (розовый и оранжевый) ctRio2 образуют короткую α -спираль, встроенную в линкерную область, которая упаковывается против С-спирали (светло-зеленый).Обозначен регион переключения GF / YT.
C) Аналогичная область hRIO2, соответствующая остаткам с 311 по 324 ctRio2, отображается в той же ориентации, что и в B. Эта область принимает расширенную конформацию α -спирали, которая проецирует C-концевой конец нижележащего α -спиральных остатков вне пределов АТФ-связывающего кармана.
D) Аналогичная область hRIO2 (PDB 6HK6) ³³ отображается в той же ориентации, что и в B и C.С-концевые остатки одного протомера hRIO2 образуют β -лист с остатками петли β 6- α 5 другого протомера (серым цветом).
Поверхность гомодимеризации RIO2 сохраняется у эукариот
Насколько нам известно, димеризация afRio2 или ctRio2 не наблюдалась в опубликованных кристаллических структурах ^26,30. Пытаясь понять это несоответствие с hRIO2, мы посмотрели на выравнивание последовательностей ортологов белка Rio2, чтобы выявить горячие точки сохранения остатков (рис.S3). Затем мы построили график сохранения остатков для разных видов на поверхности атомной модели hRIO2 с помощью веб-сервера ConSurf ³⁴ (рис. 4). Когда рассматриваются все виды, сохранение последовательности ограничивается АТФ-связывающим карманом (рис. 4A и 4B). Однако, когда консервация последовательности рассчитывается с использованием только эукариотических последовательностей или многоклеточных эукариотических последовательностей, инвариантные остатки группируются не только в АТФ-связывающем кармане, но также вдоль границы раздела димеров (рис. 4C-4E). Следует отметить, что та же самая площадь поверхности используется для ассоциации Rio2 с 20S пре-рРНК (спирали 1, 18, 28, 34 и 44), Tsr1, Ltv1, uS12, us7, uS13 и uS19 ^28,29.Механизм перекрытия для подмножества остатков, которые участвуют в ассоциации пре-40S частиц и образовании димеров, предполагает, что если димеризация существует in vivo, , она несовместима с ассоциацией пре-40S. Наложение ctRio2 и hRIO2 предполагает, что α I предотвращает образование димера ctRio2. Это наблюдение согласуется с отсутствием димера ctRio2 в экспериментах с AUC. Также интересно отметить, что специфическая для эукариот спираль α I неупорядочена в недавней структуре частицы ^28,29 до 40S, что позволяет предположить, что α I является мобильной вторичной структурой, которая не может быть участвует в катализе АТФ при созревании до 40S.
Рис. 4: Интерфейс гомодимера RIO2 сохраняется у эукариот.
Консервация последовательности была рассчитана с использованием сервера Consurf (http://consurf.tau.ac.il/), и выравнивание последовательностей показано на рис. S2. Сохранение выше 70%, 80%, 90% и равное 100% показано градиентом от белого к пурпурному.
A) Структура протомера hRIO2 (1-353) Δ (131-146). Помечены N- и C-концы, а также АТФ-связывающий карман.
B) Консервация последовательности во всех ортологах Rio2 отображается на поверхности hRIO2 и кластеризуется в АТФ-связывающем кармане.
C) Консервация последовательности в последовательностях эукариотического белка Rio2 отображается на поверхности hRIO2. Отпечаток пальца простирается вокруг кармана для связывания АТФ.

D) и E) Консервация последовательностей у высших эукариот ( Homo sapiens , Xenopus laevis , Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , Zea mais , Dictyostelium , Dictyostelium , Dictyostelium Aedes aegypti , Danio rerio ) отображается на поверхности структуры hRIO2.Область сохранения охватывает всю поверхность раздела гомодимеров.

Полоса показывает сохранение остатка от белого (несохраняемый) до пурпурного (идентичные остатки).

Гомодимеризация изменяет АТФ-связывающий карман

Структуры afRio2 и ctRio2 были расшифрованы в комплексе с различными лигандами, включая АДФ, АТФ и тойокамицин ^14,26. Чтобы проанализировать локальные перестройки основной цепи C α вокруг сайта связывания АТФ, ADP-связанная структура ctRio2 и структура hRIO2 были наложены друг на друга, и показана общая структура вокруг ADP (рис.5). По сравнению с ADP-связанной структурой ctRio2, лиганд-связывающий карман hRIO2 претерпел существенные локальные перестройки. Основное различие проявляется в глициновой петле (красный), которая принимает закрытую конформацию в hRIO2. В этой ориентации глициновая петля предотвращает связывание АТФ за счет стерических препятствий в положении, где должен находиться γ -фосфат молекулы АТФ (фиг. 5A и 5B). Однако даже при том, что полный АТФ не может быть размещен в этой конформации, молекула меньшего размера, такая как ингибитор, может соответствовать, что демонстрирует кристаллическая структура hRIO2 в комплексе с соединением 9 ³³.Следует отметить, что этот ингибитор занимает положение в кармане связывания лиганда, где распознается адениновый фрагмент. Глициновая петля одного протомера стабилизируется серией взаимодействий с остатками D228, R264 и Y261 соседнего протомера (рис. 5B, серый цвет), в то время как глициновая петля также стабилизируется посредством взаимодействий между G104 и h355, E106 и Q249. Примечательно, что каждый остаток, участвующий в стабилизации глициновой петли, является высококонсервативным у разных видов (рис. S3). Несмотря на множество попыток пропитать кристаллы различными аналогами АТФ или инкубировать образец белка до кристаллизации с аналогами АТФ, нам так и не удалось ни получить лигандированную форму hRIO2, ни кристаллизовать мономерный из них.В целом, эти находки предполагают согласованный молекулярный механизм, с помощью которого гомодимеризация hRIO2 способствует образованию нелигандированной формы белка.

Рис. 5: Образование гомодимера закрывает АТФ-связывающий карман.

структур ctRio2 и hRIO2 наложены друг на друга и отображаются отдельно.

A) АТФ-связывающий карман ctRio2 в комплексе с ADP (код PDB 4GYI) ²⁶. Указаны остатки, участвующие в связывании АДФ, и остаток фосфо-аспартата (p-D257).Ион Mn ²⁺ также показан бежевым цветом.

B) АТФ-связывающий карман RIO2 человека показан в той же ориентации, что и ctRio2. Отображаются эквивалентные остатки, участвующие в связывании АДФ в ctRio2. Остатки, принадлежащие соседнему протомеру hRIO2, заштрихованы серым цветом.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этой статье мы сообщаем о кристаллической структуре трех различных конструкций протеинкиназы RIO2 человека. Эти структуры простираются от N-конца до остатков 290 и 312 из 552 остатков полноразмерного hRIO2.Гомодимерные формы hRIO2 наблюдались во всех случаях, и лиганд не был обнаружен в АТФ-связывающем кармане. Образование димеров зависит от сети взаимодействий, приводящих к движению внутрь глициновой петли к АТФ-связывающему карману, что приводит к частичному закрытию АТФ-связывающего кармана. Глициновая петля (P-петля) как роль в стимуляции гидролиза АТФ и связывании pre-40S ²⁷. Остатки, участвующие в образовании димеров, высоко консервативны у высших эукариот. Однако эти же остатки также участвуют во взаимодействии частиц до 40S.В отсутствие доказательств in vivo , мы не можем исключить возможность того, что эти остатки сохраняются только для ассоциации пре-40S частиц.

Недавно другая группа сообщила о кристаллической структуре hRIO2 в комплексе с ингибитором ³³. В их исследовании усеченная на С-конце версия (остатки от 1 до 329) hRIO2 кристаллизовалась с 10 молекулами на асимметричную единицу, из которых только восемь обнаружены в виде димеров и две молекулы в качестве протомеров. Это наблюдение, в дополнение к анализу SEC, позволило предположить, что hRIO2 является мономером в растворе.Изучение кристаллической решетки показывает, что два изолированных протомера, обнаруженные в асимметричной единице, образуют димеры с соседними протомерами в соседней асимметричной единице. Таким образом, в кристаллической структуре действительно не наблюдается изолированного протомера. Как мы также наблюдаем, димеризация hRIO2 увеличивается с концентрацией белка, но независимо от присутствия ингибитора. Ингибитор, наблюдаемый у Wang et al. лежит на границе раздела двух молекул в кристаллической упаковке, а не на границе димера как таковой .Таким образом, ингибитор, вероятно, будет важен для кристаллизации белка в их условиях, но не для димеризации.

В других протеинкиназах димеризация является общим признаком, управляющим их активацией ^35,36. Например, этот процесс описан для киназ EGFR, RAF и CHK2 ³⁷. В случае B-RAF димеризация происходит на противоположной стороне АТФ-связывающего кармана и оставляет белок способным связывать АТФ ³⁸. В целом, предполагается, что активация происходит посредством аллостерического механизма, в котором один из протомеров действует как каркасный белок (активирующая киназа) для стабилизации активной конформации другого протомера (принимающей киназы).Димеризации протеинкиназы CHK2 способствует фосфорилирование остатка T68 киназой ATM, что приводит к активации CHK2 посредством аутофосфорилирования ³⁷. После фосфорилирования димер CHK2 быстро диссоциирует на протомеры. В hRIO2 димер блокирует АТФ-связывающие карманы в конформации, в которой АТФ не может быть размещен, по механизму, противоположному CHK2. Другим примером образования гомодимеров является Legionella pneumophila LegK4 киназа ³⁹.В структуре LegK4 белок димеризуется через α F, α G и α G- α I петлю C-доли как в связанном состоянии апо, так и в AMP-PNP, что отличается от образование димера наблюдается для hRIO2. Наконец, в крио-ЭМ реконструкциях дрожжевых и человеческих частиц до 40S только протомер белка Rio2 может быть вписан в приписываемую плотность для Rio2 ^{26,28,29,40,41}. В целом эти данные убедительно свидетельствуют о том, что димерная форма in vitro RIO2 является неактивной формой.

C-концевые остатки, описанные в структурах ctRio2 и hRIO2, обнаруживают разные конформации. В димерной форме hRIO2 они обеспечивают дополнительные взаимодействия и расширяют границу раздела димеров. В мономерной форме ctRio2 C-концевая спираль несовместима с образованием димера и участвует во взаимодействиях вокруг каталитического центра, которые могут включать аутоингибирующее действие по отношению к катализу ATP ²⁶. Наконец, в крио-ЭМ реконструкции частиц до 40S эта специфическая для эукариот α -спираль не наблюдается ^28,29.

Несколько точечных мутаций нарушают активность киназы hRIO2. Это случай двойной мутации K123A / D246A в hRIO2 ¹³ и замены D229A в Rio2 ²². На основе комплексных структур ctRio2 / ADP двойная мутация K123A / D246A влияет на распознавание АТФ (рис. 5A и 5B), в то время как замена D228A может иметь двойной эффект как на каталитическую активность, так и на образование димера. Действительно, в наших структурах боковая цепь D228 (D229 в ctRio2) указывает на соседний протомер hRIO2, а не на карман связывания АТФ.Это предполагает, что идентичный набор остатков используется для распознавания / катализа АТФ или активации пептидного субстрата и образования димера. Это был бы изящный молекулярный механизм для разделения активных и неактивных форм фермента.

На этой стадии и в отсутствие in vivo доказательств димеризации hRIO2 реальная биологическая роль димера hRIO2 остается неуловимой, и могут быть сформулированы только предположения. Были предприняты попытки понять транспорт рибосомных белков и РНК через комплекс ядерных пор ^42–44, однако имеются ограниченные знания о AF, необходимых для биогенеза рибосом, которые должны (ре) импортироваться в ядрышко ^43,45.Для дрожжей Rio2 было показано, что они обладают C-концевым NES, необходимым для управляемого Crm1 экспорта частиц pre-40S ³². У человека hCRM1 связывает остатки с 391 по 403 hRIO2 как NES ³¹. hRIO2 обнаруживается в клетке в низкой концентрации по сравнению с другими AF, такими как hNOB1 и hPNO1 ^25,46. Будучи в основном цитозольным, он включается на ядерных стадиях созревания пре-рибосом. Это подразумевает эффективный импортный механизм утилизации hRIO2, поскольку его количество является ограничивающим шагом.Действительно, истощение свободного пула Rio2 наблюдается при предотвращении его высвобождения из частиц до 40S ²⁶. Таким образом, пул доступного Rio2 полностью иммобилизован на частицах до 40S. Наличие Rio2 в качестве димера в апо-форме может сочетать несколько преимуществ.

Димеризация будет: i) предотвращать повторную ассоциацию Rio2 с предварительно созревшими или зрелыми частицами 40S в цитоплазме после его высвобождения, ii) предотвращать активность АТФазы, когда она не связана с частицей до 40S, iii) требуется для ее импорта.Что касается этого последнего пункта, никакой классический NLS не может быть идентифицирован из первичной последовательности, и никакой importin еще не был связан с импортом Rio2. В качестве альтернативы можно было бы предусмотреть использование любого импортина в случайной и интуитивной манере. Об образовании димера для ядерного импорта сообщалось в случае uS3 (RpS3). В этом механизме ядерный импорт uS3 сопровождается Yar1, а тройной комплекс входит в ядро посредством Kap60 / Kap95 ^43,47. Диссоциации димера должен способствовать внешний, но еще не идентифицированный фактор.В случае afRio1 и hRIO1 было показано, что олигомерное состояние белка влияет на его киназную активность ⁴⁸ и что аутофосфорилирование играет важную роль в таком механизме. Переход от неактивного цитоплазматического и димерного состояния к ядерно-активному и мономерному состоянию остается предметом дальнейших исследований. Однако он обеспечивает захватывающий регуляторный механизм для реимпорта специфических AF в ядро после их цитоплазматического высвобождения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструкции

Все конструкции секвенировали, чтобы гарантировать отсутствие мутаций.Человеческие конструкции киназы RIO2 1-321, а также 1-353 и 1-321 с удаленными остатками 131-150 были амплифицированы из ДНК, кодирующей полноразмерный hRIO2, и субклонированы в Nde I и BamH I. сайты модифицированной плазмиды pET-15b (Novagen) ⁴⁹ для получения слитого с N-концевой His-меткой белка, содержащего сайт расщепления TEV и маркер устойчивости к ампициллину. Chaetomium thermophilum (ct) Rio2 (любезный подарок от N. Laronde-Leblanc) был субклонирован в плазмиду, полученную из pET-15b, для получения N-концевого His-меченного белка.

Экспрессия и очистка белка

Различные конструкции трансформировали в клетки E.coli BL21 (DE3) Gold. Культуры выращивали при 37 ° C в среде 2xYT с добавлением 100 мг / л ампициллина и 30 мг / л канамицина. Клетки индуцировали при 20 ° C 0,5 мМ IPTG в течение 14 часов, собирали центрифугированием при 4500 g и ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, pH 8,0, с 350 мМ или 900 мМ NaCl. Осадки клеток лизировали с помощью Emulsi Flex-C3 (Avestin) и центрифугировали при 50 000 g.Лизат клеток объединяли со смолой His-Select Co ²⁺ (Sigma) в течение 1 часа при 4 ° C. Смолу, содержащую связанные белки, промывали 5 объемами колонки буфера для ресуспендирования, и белковые комплексы элюировали градиентом имидазола 10 мМ — 250 мМ. hRIO2 (1-321), hRIO2 (1-321) Δ (131-146) и hRIO2 (1-353) Δ (131-146) были дополнительно очищены с помощью хроматографии HiQ-Sepharose (GE Healthcare). с последующей эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare).Селенометионин-замещенный белок hRIO2 (1-321) Δ (131-146) очищали таким же образом, как нативный hRIO2 (1-321).

Аналитическое ультрацентрифугирование

Аналитические эксперименты по ультрацентрифугированию проводили в приборе Beckman Coulter ProteomeLab XL-I (IGBMC Structural Biology Platform) при 4 ° C. Белки ctRio2 и hRIO2 (1-321) Δ (131-46) были независимо очищены и диализованы против буфера, содержащего 25 мМ Tris-HCl pH 7,4, 300 мМ NaCl и 5% глицерин (мас. / об.).Для аналитических экспериментов со скоростью седиментации ультрацентрифугированием при 50000 об / мин 400 мкл серии концентраций каждого белка готовили в диализном буфере с конечной концентрацией 60, 30, 15, 7,5 и 3,75 мкМ для ctRio2 и 54, 27, 13,5, 6,75. и 3,375 мкМ для hRIO2. Сканирование абсорбции при 280 нм и сканирование интерференции выполняли каждые 5 минут. Данные седиментации сначала были проанализированы с использованием программного обеспечения SEDFIT ⁵⁰, и была сгенерирована модель непрерывного распределения коэффициента седиментации c (s), а затем экспортирована в SEDPHAT для согласования с гибридной локальной моделью непрерывного распределения ⁵¹.Плотность буфера, вязкость буфера и парциальные удельные объемы белка рассчитывались с использованием программного обеспечения SEDNTERP. GUSSI использовался для интегрирования пиков седиментации и построения графиков ⁵².

Кристаллизация и определение структуры

Перед кристаллизацией нативный hRIO2 (1-321), hRIO2 (1-353) Δ (131-146) и замещенный селенометионином hRIO2 (1-321) Δ (131 -146) белки заменяли в буфере, содержащем 25 мМ Трис, pH 7.5, 900 мМ или 350 мМ NaCl (соответственно), 1,0 мМ DTT и концентрировали до 10 мг / мл. Комплексы кристаллизовали при 20 ° C методом сидячей капли против резервуара, содержащего условие D2 или G2 экрана Morpheus ™ (Molecular Dimensions). Кристаллы переносили в криопротектор с 60% EDO-P8K, мгновенно замораживали в жидком азоте и выдерживали при 100 К с помощью криопотока азота во время сбора данных.

Кристаллы hRIO2 (1-321) и hRIO2 (1-321) Δ (131-146) относятся к пространственной группе P 2 ₁ с размером элементарной ячейки a = 69.13 Å b = 88,30 Å c = 102,14 Å и содержат четыре молекулы на асимметричную единицу. Кристаллы hRIO2 (1-353) Δ (131-146) относятся к пространственной группе P 6 ₅ с размерами элементарной ячейки a = 67,55 Å b = 67,55 Å c = 312,2 Å

Структура hRIO2 (1-321) Δ (131-146) был решен методом SAD с использованием кристаллов селенометионинзамещенного белка. Наборы данных были сокращены с помощью XDS ⁵³. 40 сайтов селена были обнаружены с помощью SHELXCD ⁵⁴ и уточнены с помощью Phaser ⁵⁵.Первоначальная модель была построена с использованием Bucaneer ⁵⁶. Окончательные модели были усовершенствованы с помощью BUSTER 2.10 ⁵⁷ и демонстрируют хорошую стереохимию (Таблица 1). Атомная модель hRIO2 (1-321) Δ (131-146) содержит остатки 6-312. Атомная модель hRIO2 (1-353) Δ (131-146) содержит остатки 9-314. Атомная модель hRIO2 (1-321) включает остатки с 12 по 291, за исключением петель 66-70 и 129-149.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была поддержана грантом ANR Blanc 2010 RIBOPRE40S, Университетом Бордо, CNRS и INSERM.Авторы выражают признательность за поддержку и использование ресурсов Французской инфраструктуры интегрированной структурной биологии FRISBI ANR-10-INBS-05 и Instruct-ERIC.

ВКЛАД АВТОРОВ

FM и NP экспрессировали, очищали и кристаллизовали Rio2 человека. ST выполнила анализ киназы. SF решила и доработала структуру. SF проанализировал данные, написал статью и руководил работой.

ЗАЯВЛЕНИЕ О РАСКРЫТИИ ИНФОРМАЦИИ

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Вспомогательная информация

Вспомогательные материалы и методы

Анализ киназы

Активность аутофосфорилирования киназы RIO2 тестировали с использованием белка Rio2 из Chaetomium thermophilum и из Homo sapiens . Для более поздних видов были проанализированы три конструкции: полноразмерный белок (hRIO2), усечение которого соответствует res. От 1 до 353, включая удаление петли между рез. 131-146 (hRIO2 (1-353) Δ (131-146)) и усечение из рез.От 1 до 321, включая удаление петли между рез. 131-146 (hRIO2 (1-321) Δ131-146). Белки очищали до гомогенности, используя протокол, указанный в разделе «Материалы и методы». Каждый белок инкубировали с γ- [32P] АТФ в течение 120 мин при 37 ° C в буфере, содержащем 25 мМ Трис pH 7,4, 150 мМ KCl, 10% глицерин и 5 мМ MgCl ₂. Контрольные реакции инкубировали с дополнительными 50 мМ ЭДТА для хелатирования ионов магния. Все реакции останавливали добавлением буфера Лэммли и загружали в 12.5% SDS-PAGE, проводили в течение 2 ч при 160 В и рентгенографировали.

Рисунок S1: Активность аутофосфорилирования hRIO2

Тест активности аутофосфорилирования киназы Rio2 описан в дополнительных данных. HRIO2 (1-321) Δ (131-146) тестировали с использованием двух количеств белка (3 мкг и 12 мкг, дорожки 1 и 2 соответственно). Контрольные реакции измеряли в присутствии (дорожки 1 и 2) или в отсутствии (дорожки 3 и 4) Mg ²⁺. Три другие конструкции были протестированы и использованы в качестве положительных контролей (полноразмерный hRIO2 и ctRio2) для hRIO2 (1-353) Δ (131-146).Каждый эксперимент проводился с 10 мкг белка в одинаковых экспериментальных условиях. Активность аутофосфорилирования Rio2 анализировали, как описано у Zemp et al. ¹. hRIO2 полноразмерный, ctRio2 использовали в качестве положительного контроля для hRIO2 (1-321) Δ (131-146) и hRIO2 (1-353) Δ (131-146).

Рисунок S2: Общее сходство hRIO2, afRio2 и ctRio2

Модель RIO2 (1-321) человека использовалась в качестве эталона для наложения hRIO2 (1-321) Δ (131-146) (A), afRio2 (B) и ctRio2 (C) показан серым цветом.Общая среднеквадратичная величина указан под цифрой. Мотивы прототипов киназ представлены в цвете. Отображаются так называемая C-спираль (светло-зеленый), F-спираль (пурпурный), петля глицина (красный), каталитический цикл (синий) и цикл активации (черный).

Рисунок S3:

Выравнивание последовательностей ортологов Rio2. Выравнивание последовательностей было выполнено с использованием Chimera ² и отображено с помощью SEAVIEW ³. Вторичные структуры отображаются поверх последовательности.Ключевые остатки, обсуждаемые в рукописи, помечены красной звездочкой.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Европейский центр синхротронного излучения за предоставление средств синхротронного излучения, и мы хотели бы поблагодарить сотрудников за помощь в использовании лучевых каналов ID14-1 и ID29. Мы также благодарим синхротрон SOLEIL и докторов Пьера Леграна и Эндрю Томпсона за предоставление доступа к каналу пучка Proxima-1. Мы благодарим Н. Ларонд-Леблан за предоставление плазмиды ctRio2.Мы благодарим C.D. Mackereth за критическое прочтение рукописи.

Молекулярные графики и анализы были выполнены с помощью пакета UCSF Chimera. Chimera разработана Ресурсом по биокомпьютингам, визуализации и информатике Калифорнийского университета в Сан-Франциско (при поддержке NIGMS P41-GM103311).

ССЫЛКИ

1.↵
2.↵
3.↵
4.
5.
6.
7.
8.↵
9.↵
10.↵
11.↵
12.
13.↵
14.↵
15.↵
16.↵
17.↵
18.↵
19.
20.↵
21.↵
22.↵
23.↵
24.↵
25.↵
26.↵
27.↵
28.↵
29.↵
30.↵
31.↵
32.↵
33.↵
34.↵
35.↵
36.↵
37.↵
38.↵
39.↵
40.↵
41.↵
42.↵
43.↵
44.↵
45.↵
46.↵
47. ↵
48.↵
49.↵
50.↵
51.↵
52.↵
53.↵
54.↵
55.↵
56.↵
57. ↵
Bricogne G, Blanc E, Brandl M, Flensburg C, Keller P, Paciorek W, Roversi P, Smart OS, Vonrhein C, Womack T.

Инвитро или cmd: Где дешевле и лучше сдавать анализы в Москве